肾与肝移植受者供体来源游离DNA在血浆与尿液中的变异度及纵向动态变化：绝对量与相对量的比较

背景：供体来源游离DNA（donor-derived cell-free DNA，ddcfDNA）正日益被整合入实体器官移植受者的临床实践中以检测同种异体移植物排斥反应。ddcfDNA的自然波动或其他状况可影响结果判读。因此，研究人员调查了肾移植（kidney transplantation，KT）与肝移植（liver transplantation，LT）受者术后前2年内ddcfDNA的趋势，评估血浆与尿液中ddcfDNA绝对量（ddcfDNAcp/mL）与相对量（ddcfDNA%）的个体内（intra-individual）与个体间（inter-individual）变异性。此外，研究人员分析了KT受者尿液ddcfDNA并行其与血浆ddcfDNA及其他生物标志物的比较。 方法：于定期随访时纵向收集KT和LT受者的血液与尿液标本。利用供受者间错配的HLA-DRB1等位基因，通过微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）测定ddcfDNA的绝对量（ddcfDNAcp/mL）与相对比例（ddcfDNA%）。 结果：研究发现稳定KT血浆中ddcfDNA绝对量与分数形式的个体内与个体间变异性相当。稳定与非稳定LT血浆中，个体内变异性占总方差的主要部分。KT尿液ddcfDNA的分数形式存在性别间的个体间变异性差异。 结论：个体内变异性占比较大提示在检测同种异体移植物损伤时，除固定界值外还应纳入个体ddcfDNA动态变化。在LT及KT尿液ddcfDNA分析中，ddcfDNAcp/mL应与ddcfDNA%一并考量，因其似更直接反映移植物状态。

论文解读：供体来源游离DNA在肾与肝移植受者血浆与尿液中的变异度及纵向动态变化研究

本研究发表于《Frontiers in Transplantation》。目前供体来源游离DNA（donor-derived cell-free DNA，ddcfDNA）作为实体器官移植后无创监测同种异体移植物损伤的生物标志物日益受到关注，血浆ddcfDNA（p-ddcfDNA）升高与急性排斥反应或移植物功能障碍相关。然而，ddcfDNA波动的影响因素尚不清楚——个体内（intra-individual）变异可能反映免疫活性、依从性或移植物健康变化，个体间（inter-individual）变异可受移植物类型或基线ddcfDNA turnover影响，这些变异性可干扰临床判读，提示除固定阈值外还需考虑个体动态基线。此外，绝大多数研究聚焦血浆 fractional ddcfDNA（ddcfDNA%），而绝对量（ddcfDNA_cp/mL）的价值及尿液ddcfDNA（u-ddcfDNA）在肾移植中的纵向变异性数据有限。为此，研究人员开展了一项前瞻性纵向观察研究，比较KT与LT受者术后2年内血浆与尿液ddcfDNA绝对量与相对量的个体内与个体间变异性，分析尿与血浆ddcfDNA的相关性，并探讨早期ddcfDNA对移植物功能的预测价值。

主要技术方法与队列

研究人员在瑞士伯恩大学医院Inselspital招募成年肾移植（KT，n=61分析）、肝移植（LT，n=49分析）受者及健康对照。按标准将患者分为稳定组（无移植物损伤证据、功能稳定）、非稳定组（有for-cause活检或eGFR下降/多次转氨酶升高）及早期移植组（术后10天内）。采集外周血（K₃E抗凝）及尿液（加Urine Preserve保存），提取cell-free DNA（cfDNA）。采用基于HLA-DRB1错配或SRY基因的ddPCR（droplet digital PCR）法测定供体特异性等位基因拷贝数，以RPP30为内参基因计算总cfDNA；分别按公式算出绝对ddcfDNA浓度（ddcfDNA_cp/mL，尿液经尿肌酐UCr校正得ddcfDNA_{UCr adj.}[cp/μmol]）与fractional ddcfDNA（ddcfDNA%＝供体ddcfDNA拷贝数/总cfDNA拷贝数×100％）。统计学采用线性混合效应模型（考虑重复测量随机截距）、方差分析（VCA包）分解inter-sex、inter-individual及intra-individual方差分量，Pearson或Kendall相关，p＜0.05为差异有统计学意义。

研究结果

3.1 Patient characteristics

描述了早期、稳定及非稳定KT与LT各组的人口学、供体类型、缺血时间、原发病因等基线特征，组间均衡可比。

3.2 ddcfDNA early post-transplantation

KT（n=25）与LT（n=22）受者术后前10天血浆p-ddcfDNA无论是绝对量还是分数均呈总体下降趋势，尤以LT明显；KT尿液fractional ddcfDNA（u-ddcfDNA%）无明显动态，但绝对尿ddcfDNA（u-ddcfDNA_cp/mL）在术后最初几天下降。供体类型（DCD vs DBD）及总缺血时间与早期ddcfDNA无显著相关。术后7天(±3天)的ddcfDNA_cp/mL及ddcfDNA%均不能显著预测KT受者6或12个月时的eGFR或LT受者ALT。

3.3 Impact of the time post-transplantation on ddcfDNA quantities

采用混合效应模型分析术后2年内时间对ddcfDNA的影响，发现仅稳定LT的p-ddcfDNA%及非稳定KT的p-ddcfDNA%随术后时间呈弱正相关，其余血浆或尿液ddcfDNA绝对量或分数在术后2年内未受移植后时间显著影响。

3.4 Comparison of plasma and urinary ddcfDNA in KT

在稳定KT中，校正个体重复测量后p-ddcfDNA%对u-ddcfDNA%有显著正向影响（β=37.0，p=0.004），但血浆与尿液的绝对量及非稳定组两者均无显著关联；早期移植组亦无血浆对尿液的显著影响。eGFR与u-ddcfDNA各指标（绝对及分数）在稳定、非稳定及早期组中均无显著相关性，提示尿ddcfDNA并非单纯经肾小球滤过，可能直接来源于移植物局部脱落。

3.5 Variance components for longitudinal ddcfDNA

稳定KT血浆p-ddcfDNA_cp/mL与p-ddcfDNA%的个体内与个体间变异性相近且总体变异相当；非稳定KT及LT（无论稳定或非稳定）血浆ddcfDNA方差主要由个体内变异性贡献，个体间变异性占比很小，LT中非稳定组p-ddcfDNA_cp/mL个体内变异增大更明显。KT尿液fractional ddcfDNA（u-ddcfDNA%）显示可归因的inter-sex方差分量（女性分数普遍低于男性），而u-ddcfDNA_cp/mL（UCr校正后）受性别影响小。稳定KT尿液ddcfDNA%的个体间变异性大于血浆。

3.6 Correlation with other biomarkers

LT中p-ddcfDNA_cp/mL与p-ddcfDNA%均与谷丙转氨酶（ALAT）、谷草转氨酶（ASAT）显著相关（尤早期与非稳定组驱动），且与白细胞计数正相关（早期组贡献大），与他克莫司（tacrolimus）血药浓度负相关。KT中p-ddcfDNA与血肌酐及对应eGFR显著相关；u-ddcfDNA_cp/mL与血肌酐、eGFR、白细胞计数及C反应蛋白（CRP）在全样本水平显著相关但非单组内；他克莫司血浓度与KT尿ddcfDNA_cp/mL呈正相关，提示可能与肾毒性致肾小管释放增加有关。

讨论与结论总结

研究人员发现非稳定KT与LT患者ddcfDNA个体内变异性高于稳定受者，提示ddcfDNA可用于个体化移植物监测。KT血浆绝对量与分数ddcfDNA总变异性及组分相似，二者具互补价值。LT中p-ddcfDNA_cp/mL与肝酶相关性更强且个体内变异模式更优，推荐LT除fractional ddcfDNA外应同时定量绝对ddcfDNA。KT尿与血浆ddcfDNA在非稳定状态下相互独立，u-ddcfDNA%存在性别及较大个体间差异，故尿液ddcfDNA研究应纳入经UCr校正的绝对量（u-ddcfDNA_cp/mLUCr-adj.）。他克莫司血药浓度与KT尿ddcfDNA_cp/mL正相关（提示潜在肾毒性释放），与LT血浆ddcfDNA负相关（提示免疫抑制有效）。局限性包括配对尿血样本量偏小、排斥及BK病毒肾病例数少、无协议活检确认稳定组、随访约2年及未校正多重比较。

结论（翻译）

个体内变异性在总方差中占比较大，提示在检测同种异体移植物损伤时应将个体ddcfDNA动态变化纳入固定界值判读。对于LT及KT尿液ddcfDNA分析，ddcfDNA_cp/mL应与ddcfDNA%一并考量，因其似乎更直接反映移植物状态。