背景：红花黄色素注射液（SYI）已被证实对心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤具有心脏保护作用。本研究旨在探讨其机制基础。
方法：研究人员在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）暴露前，用80 μg/mL SYI预处理H9c2细胞24小时。通过蛋白质印迹法（WB）检测与内质网（ER）应激和细胞凋亡相关的蛋白水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和定量聚合酶链反应（qPCR）测定白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白及mRNA水平。分别使用CCK-8检测和流式细胞术测量细胞活力和细胞凋亡。此外，通过WB实验检测了HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达。最后，使用重组HMGB1（rHMGB1）进行了挽救验证。
结果：SYI处理减轻了OGD/R诱导的H9c2细胞内质网应激，并降低了IL-6和TNF-α水平。这些变化伴随着细胞活力的增加以及OGD/R诱导的细胞凋亡的减少。从机制上讲，SYI显著抑制了OGD/R触发的H9c2细胞中HMGB1/TLR4/NF-κB信号级联反应的激活。随后使用重组HMGB1（rHMGB1）进行的挽救实验逆转了SYI对OGD/R损伤的保护作用。
结论：这些发现表明，HMGB1/TLR4/NF-κB轴介导了SYI对心肌OGD/R损伤的保护作用，这可能是通过调节内质网应激和炎症反应实现的。本研究为SYI在体外的心脏保护作用提供了机制基础，并为未来评估其治疗潜力的研究提供了参考。然而，这些结果仅来源于基于细胞的实验，需要在动物模型中进行进一步验证以确认该机制的体内相关性。
论文解读
研究背景
心肌缺血（myocardial ischemia, MI）是一种常见且发病率和死亡率较高的心血管疾病。目前，经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）等再灌注疗法是挽救缺血心肌的标准手段，但再灌注过程本身可能导致心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion, MI/R）损伤，增加患者长期不良心血管事件风险，严重影响生活质量。MI/R损伤的病理生理机制复杂，涉及内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激、氧化应激、线粒体损伤、钙超载、细胞凋亡和自噬等多种途径。其中，缺血损伤刺激会导致未折叠或错误折叠蛋白积累，从而触发ER应激，而急性MI/R阶段或PCI治疗后ER应激水平升高与不良预后密切相关，因此缓解ER应激并恢复其稳态对于减轻MI/R损伤具有重要意义。
天然化合物和传统中药在缓解MI/R损伤方面展现出良好疗效。红花黄色素注射液（safflower yellow injection, SYI）源自中药红花（Carthamus tinctorius L.），其主要生物活性成分羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A, HSYA）具有抗凝、抗血栓、抗氧化、抗炎等多种药理作用，已广泛应用于心血管疾病的临床治疗。然而，SYI对抗MI/R损伤的保护机制研究仍有限。已有研究表明，SYI可通过抑制氧化应激和ER应激减轻MI/R损伤，且SYI能通过TLR4/NF-κB炎症通路发挥对大鼠MI/R损伤的保护作用，另有研究发现红花黄色素可通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路改善脊髓损伤，但SYI是否通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB通路和ER应激来减轻MI/R损伤尚不清楚。因此，研究人员通过建立体外OGD/R模型，旨在明确SYI对OGD/R诱导的ER应激和炎症反应的影响，并探讨其介导心肌保护的潜在通路。
关键技术方法
研究人员采用大鼠心肌细胞系H9c2建立氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）模型模拟MI/R损伤。细胞经SYI预处理后，通过蛋白质印迹法（western blot, WB）检测ER应激、细胞凋亡及HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）分别检测细胞上清中炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的蛋白及mRNA水平；利用CCK-8法和流式细胞术分别评估细胞活力和细胞凋亡情况。为验证HMGB1的作用，研究人员使用重组HMGB1（recombinant HMGB1, rHMGB1）进行挽救实验。所有数据均采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行分析，以均数±标准差（mean ± standard deviation, SD）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）或双因素方差分析（two-way ANOVA），以P < 0.05为差异有统计学意义。
研究结果
3.1 SYI减少H9c2细胞中OGD/R引起的内质网应激和炎症反应
研究人员通过WB检测发现，OGD/R暴露显著上调了H9c2细胞中ER应激相关蛋白（ATF6、GRP78、Caspase-12、CHOP）的表达，而SYI处理可抑制这一效应。同时，ELISA和qRT-PCR结果显示，SYI能明显逆转OGD/R诱导的促炎细胞因子IL-6和TNF-α在蛋白和mRNA水平的升高。这表明SYI可能通过减轻ER应激和炎症反应来保护H9c2细胞免受OGD/R损伤。
3.2 SYI增强OGD/R处理的H9c2细胞的活力并抑制其凋亡
CCK-8实验显示，OGD/R损伤显著降低H9c2细胞活力，而SYI处理可逆转此效应。WB实验结果表明，OGD/R明显升高促凋亡蛋白（Bax、Caspase-3）水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，但SYI处理恢复了这些凋亡相关蛋白的水平。流式细胞术进一步证实了SYI能够抑制OGD/R诱导的H9c2细胞凋亡。
3.3 SYI抑制OGD/R触发的H9c2细胞中HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活
WB实验检测发现，OGD/R暴露的H9c2细胞中HMGB1、TLR4、MyD88蛋白表达以及NF-κB P65和IκBα的磷酸化水平均显著升高，而SYI干预可使该通路失活。这提示SYI对H9c2细胞抵抗OGD/R损伤的保护作用可能部分归因于对该信号通路的抑制。
3.4 rHMGB1阻碍SYI对OGD/R介导的H9c2细胞ER应激和炎症反应的作用
为评估HMGB1在SYI保护H9c2细胞抵抗OGD/R损伤中的作用，研究人员进行了rHMGB1挽救实验。结果发现，rHMGB1减弱了SYI对OGD/R后H9c2细胞ER应激相关蛋白水平的抑制作用。同时，SYI对OGD/R诱导的促炎细胞因子（IL-6、TNF-α）的抑制效应也被rHMGB1削弱。这些结果表明，SYI可能通过调控HMGB1来减少OGD/R触发的H9c2细胞ER应激和炎症反应。
3.5 rHMGB1减弱SYI对OGD/R诱导的H9c2细胞存活和凋亡的影响
CCK-8结果显示，rHMGB1消除了SYI对H9c2细胞活力的保护作用。WB和流式细胞术检测表明，rHMGB1逆转了SYI的抗凋亡效应。综上，这些结果证明SYI通过调控HMGB1抑制OGD/R诱导的H9c2细胞凋亡。
讨论与结论
讨论
植物源性天然产物代表了一种有前景的多靶点治疗策略，用于对抗MI/R损伤。既往研究表明，SYI可通过抑制氧化应激和ER应激减轻MI/R损伤，或通过抑制NLRP3炎症小体和促进自噬发挥作用，但这些研究未深入探讨触发缺血/再灌注期间ER应激的上游信号通路，也未涉及HMGB1或其与ER应激的串扰。本研究首次提供了SYI直接抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号轴的证据，且该抑制作用与OGD/R处理的心肌细胞中ER应激、炎症和凋亡的减轻功能偶联。通过rHMGB1挽救实验，研究人员证明HMGB1是SYI保护作用的关键上游介质，不仅扩展了现有知识，还建立了SYI介导的心脏保护中HMGB1/TLR4/NF-κB与ER应激之间的新机制联系，为从分子层面理解这一中药注射液的网络调控机制提供了更整合的视角。
MI/R会破坏ER稳态，导致未折叠或错误折叠蛋白积累，进而引发MI/R损伤。大量证据表明，ER应激引起的心肌细胞凋亡是MI/R损伤的重要贡献者。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78, GRP78）是ER应激的重要标志，通常与ER应激的三个基本传感器结合。ER稳态的破坏导致GRP78从这些传感器解离，随后激活ER应激信号通路。MI/R期间持续的ER应激会增加促凋亡转录因子（包括ATF6、CHOP和Caspase-12）的表达，介导ER应激相关凋亡并加剧炎症反应。本研究中，SYI显著抑制了H9c2细胞中OGD/R诱导的ER应激和炎症反应，表现为ER应激相关蛋白（ATF6、GRP78、Caspase-12、CHOP）和促炎因子（IL-6、TNF-α）水平降低；同时增强了细胞活力并抑制了凋亡，表现为Bax和Caspase-3水平降低、Bcl-2表达升高，这与既往关于SYI和HSYA减轻OGD/R诱导的炎症反应的研究结果一致，表明SYI有望成为治疗MI/R损伤的潜在靶点。
炎症被认为是MI/R损伤的关键病理生理机制，而HMGB1介导的TLR4/MyD88/NF-κB信号轴可能在调节炎症反应中发挥核心作用。尽管本研究表明SYI在OGD/R处理的H9c2细胞中同时抑制了ER应激和HMGB1/TLR4/NF-κB激活，但这两个事件之间的因果关系尚未完全阐明。既往研究显示，HMGB1可作为ER应激的上游触发因子，抑制HMGB1可减轻大鼠MI/R损伤中的ER应激；反之，ER应激本身也可激活NF-κB并促进炎症， prolonged ER stress可诱导受损细胞释放更多HMGB1。因此，HMGB1/TLR4/NF-κB信号与ER应激之间存在双向串扰，而非简单的单向关系。本研究中，外源性rHMGB1逆转了SYI对ER应激标志物的抑制作用，支持HMGB1在本模型中至少部分作为ER应激的上游介质。但当前数据尚未确定SYI是直接抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号进而减轻ER应激，还是独立抑制这两条通路。未来需结合ER应激诱导剂（如衣霉素或毒胡萝卜素）及ER应激调节因子的基因调控来进一步阐明。
氧化应激和线粒体功能障碍在MI/R损伤中也起重要作用。虽本研究未直接检测这些通路，但现有证据表明SYI及其主要活性成分HSYA可通过多种机制发挥心脏保护作用，如提高SOD活性、降低MDA和ROS水平以减轻氧化应激；抑制缺氧/复氧期间线粒体渗透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）开放；通过苹果酸脱氢酶1（malate dehydrogenase 1, MDH1）改善线粒体功能，恢复线粒体极化和膜电位，增加ATP生成；以及通过HIF-1α/SLC7A11/GPX4通路抑制铁死亡。这些通路相互关联，HMGB1/TLR4/NF-κB信号可加剧氧化应激，而氧化应激又可触发ER应激和线粒体功能障碍。因此，尽管本研究聚焦于HMGB1/TLR4/NF-κB-ER应激轴，SYI也可能直接或间接通过抑制该通路调控氧化应激和线粒体功能，未来应同步检测ROS水平、线粒体膜电位和ATP生成，并结合通路特异性干预来明确各机制的相对贡献。
本研究存在一定局限性：首先，所有实验均在H9c2细胞系中进行，缺乏动物模型验证，未来需在大鼠或小鼠中建立MI/R模型，在全器官水平验证SYI通过HMGB1/TLR4/NF-κB轴调控ER应激和炎症反应的心脏保护作用；其次，本研究仅使用单一浓度（80 μg/mL）的SYI，虽既往文献支持其为最佳浓度，但未进行系统的量效曲线分析，未来应设立多个浓度梯度以全面评估SYI的剂量依赖性效应；第三，关于HMGB1/TLR4/NF-κB通路与ER应激的因果关系，目前仅通过外源性rHMGB1挽救实验提供了部分证据，未进行基因沉默或特异性抑制剂（如NF-κB抑制剂）的反向遗传验证，未来应纳入这些干预措施以明确SYI是直接抑制ER应激还是通过阻断HMGB1/TLR4/NF-κB通路间接发挥作用；最后，本研究未全面探究MI/R损伤的其他经典机制（如氧化应激和线粒体功能障碍），未来应在同一模型中检测ROS、线粒体膜电位和ATP水平，并结合通路特异性干预，阐明多通路协同串扰在SYI介导的心脏保护中的作用。通过多层次、多模型的验证，未来研究将有助于全面验证SYI的作用机制，推动其临床转化。
结论
综上所述，SYI通过提高细胞活力、减轻ER应激、炎症反应和细胞凋亡，减轻了H9c2细胞中的心肌OGD/R损伤。其潜在机制可能部分归因于对HMGB1/TLR4/NF-κB轴的抑制，这一点得到了rHMGB1挽救实验的进一步支持。总之，本研究结果为SYI在体外模型中的心脏保护作用提供了机制基础，并为未来评估其在MI/R损伤中的治疗潜力的研究提供了参考。
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