识别可靠的朊病毒病生物标志物仍然是一项挑战，特别是在可用于早期检测的易获取体液中。近期一项针对脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）蛋白质组的质谱分析研究鉴定并验证了五种在天然瘙痒病（scrapie）感染绵羊临床前期显著失调的蛋白质。在本研究中，研究人员定量检测了这些蛋白质在血清中的含量，并分析了它们在中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的分布及基因表达情况，同时将结果与朊病毒相关特征性神经病理学改变进行了关联分析。研究人员在临床前期动物血清中检测到突触结合胞质RNA相互作用蛋白（synaptotagmin binding, cytoplasmic RNA interacting protein, SYNCRIP）、磷脂酶D3（phospholipase D3, PLD3）和组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）水平显著升高，这与此前脑脊液研究结果一致。对这三种蛋白以及骨桥蛋白（osteopontin, SPP1）和补体成分4（complement component 4, C4）在中枢神经系统的分析显示，瘙痒病感染动物存在早期且区域特异性的免疫反应性降低，同时伴有基因表达上调，且与朊病毒相关神经病理特征显著相关。这些发现共同凸显了SYNCRIP、PLD3和CTSD作为从临床前期诊断朊病毒病的有前景的微创生物标志物的潜力，并为疾病进展过程中该五种蛋白质在中枢神经系统中的时空调控机制提供了新见解。尚需进一步研究以阐明外周生物标志物动态变化与神经退行性病变之间的关系。
朊病毒病（prion diseases)或称可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies, TSE）是一类致命的神经退行性疾病，其特征为生理性细胞朊蛋白（cellular prion protein, PrP
C )错误折叠为致病性异构体（PrP
Sc )。这种结构转化导致PrP
Sc 主要在中枢神经系统中蓄积，触发海绵状神经退行性变、神经元丢失和胶质细胞增生。TSE可影响多种物种，包括人类的克雅氏病及其散发型（sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, sCJD)、牛的牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy, BSE）以及小反刍动物的瘙痒病。其中，瘙痒病作为朊病毒病的原型被广泛研究，并作为此类疾病的模型。瘙痒病的一个关键特征是PrP
Sc 在外周淋巴组织中的早期沉积，这使得通过直肠黏膜活检检测临床前期无症状感染动物成为可能。除TSE外，多种其他神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、帕金森病（Parkinson's disease, PD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）也具有相似的蛋白质错误折叠和聚集机制。
近年来，超灵敏检测方法如蛋白质错误折叠循环扩增（protein misfolding cyclic amplification, PMCA）和实时震荡诱导转换（real-time quaking-induced conversion, RT-QuIC）的发展显著改善了朊病毒诊断，能够检测各种生物样本中的特异性PrP
Sc 。然而，PrP
Sc 分布范围的可变性以及宿主遗传学和朊病毒株的差异使得仅基于PrP
Sc 检测的诊断变得复杂。这凸显了识别额外分子生物标志物以补充PrP
Sc 作为临床症状出现前疾病指标以及疾病进展追踪的重要性。脑脊液因与中枢神经系统直接接触并反映其生化变化，是研究朊病毒发病机制生物标志物的有前景来源。但现有人类脑脊液中神经元损伤替代标志物如14-3-3蛋白和tau蛋白缺乏特异性，且主要在疾病后期才可检测。因此，识别能够在临床症状出现前检测朊病毒病并追踪疾病进展的新型生物标志物，特别是在更易获取的体液如血液中，至关重要。
近期，研究团队对瘙痒病感染绵羊的脑脊液蛋白质组进行了质谱分析，比较了临床前期和临床期疾病阶段与健康对照的差异。专注于无临床症状的临床前期阶段，研究人员鉴定了众多在该阶段相对于健康动物显著失调的蛋白质。此外，该阶段多个代谢通路发生改变，包括氧化应激反应、离子转运和炎症过程，提示临床症状出现前已存在早期分子变化。在所有失调蛋白质中，基于倍数变化和显著性数值以及此前关于朊病毒和其他人类神经退行性疾病的报道，五种蛋白质被选出进行深入研究：SYNCRIP、磷脂酶D家族成员3（phospholipase D family member 3, PLD3）、CTSD、SPP1和C4。这些蛋白质随后在脑脊液中通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行了验证。有趣的是，五种蛋白质在临床前期绵羊脑脊液中均较健康对照上调，在疾病临床期维持升高水平，除CTSD浓度恢复至健康绵羊水平外。这些结果凸显了它们作为朊病毒病及潜在其他神经退行性疾病早期诊断生物标志物的潜力。然而，这些潜在生物标志物在其他体液特别是比脑脊液更易获取、创伤更小的体液中的行为，以及驱动其在脑脊液中上调的潜在机制尚不清楚。
基于此，在本研究中，研究人员首先使用ELISA分析了临床前期和临床期瘙痒病感染绵羊以及健康对照血清中五种先前经脑脊液验证的蛋白质（SYNCRIP、PLD3、CTSD、SPP1和C4）的浓度。该分析旨在评估这些蛋白质是否也能在易于获取的外周体液中反映疾病相关变化，并评估其作为创伤更小的早期诊断生物标志物的潜力。此外，研究人员还通过探索这些蛋白质在临床前期和临床期天然瘙痒病感染绵羊中枢神经系统中的蛋白表达，进一步研究了它们在朊病毒病神经病理学中的潜在作用，将数据与健康动物进行了比较。具体而言，研究人员进行了免疫组织化学研究以分析蛋白质沉积和分布遍及中枢神经系统的多个区域，并将结果与朊病毒病的神经病理学特征相关联。为补充此项工作，研究人员还通过实时定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）评估了编码目标蛋白的基因表达水平，以深入评估基因表达变化是否反映了瘙痒病影响最严重的中枢神经系统区域中的蛋白质表达水平。
研究选用西班牙阿拉贡品种雌性绵羊，年龄3至6岁，PRNP基因型为ARQ/ARQ。瘙痒病感染绵羊选自天然瘙痒病感染羊群。临床前期绵羊通过直肠活检PrP
Sc 免疫组织化学分析检测无疾病临床症状。临床期绵羊表现出瘙痒症和共济失调等典型瘙痒病临床症状，并通过脑组织PrP
Sc 免疫组织化学检测确认感染。健康绵羊取自无瘙痒病暴发史的羊群，年龄和基因型与瘙痒病感染绵羊匹配。血清蛋白质检测和中枢神经系统基因表达分析共使用21只动物：8只健康对照、5只临床前期瘙痒病绵羊和8只出现明显瘙痒病症状的临床期绵羊。组织病理学和免疫组织化学分析选用19只动物：7只健康对照、5只临床前期和7只临床期绵羊。
血液样本通过颈静脉穿刺采集，使用无抗凝剂真空采血管。立即处理后以3100 rpm离心10分钟，血清分装保存于-80°C备用。随后动物通过戊巴比妥钠静脉注射和放血处死。尸检时采集中枢神经系统六个区域样本：颈脊髓、延髓杓状部水平、小脑、丘脑、海马和额叶皮层。鉴于瘙痒病病变模式为双侧性，样本均分为两半；一半浸入10%甲醛固定用于后续组织病理学和免疫组织化学分析，另一半中枢神经系统样本再次分割：部分组织 stabilize于RNAlater溶液后-80°C保存用于RNA提取，其余直接-80°C冻存用于蛋白质分析。
血清蛋白质分析使用与脑脊液验证相同的ELISA试剂盒，按照制造商血清样本方案及先前描述的方法进行。所有样本均做三个复孔。
甲醛固定的中枢神经系统组织从每区域和每只绵羊切取薄块并包埋于石蜡。石蜡块切片4 µm厚，37°C干燥24小时。进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色用于神经病理学改变和海绵状变性评估。PrP
Sc 检测免疫组织化学使用单克隆抗体L42完成。
五种目标蛋白的免疫组织化学分析采用热介导抗原修复，所有蛋白除C4外使用柠檬酸缓冲液96°C 20分钟，C4需使用Tris-乙二胺四乙酸（ethylene-diamine-tetraacetic acid, EDTA）缓冲液15分钟。切片与一抗溶液4°C过夜孵育，室温加抗兔酶结合二抗30分钟，使用二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色10分钟，苏木精复染5分钟，脱水后以DPX封片剂封片。所有免疫组织化学检测设置适当阴性对照，以种属匹配IgG同型对照替代一抗。切片还进行神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫检测作为星形胶质细胞标志物，以及离子化钙结合衔接分子1（ionised calcium binding adaptor molecule 1, Iba1）作为小胶质细胞标志物。
组织病理学和免疫组织化学评估在六个脑区进行，每区域评估多个代表性区域：颈脊髓包括白质和灰质；延髓杓状部水平包括楔束核、迷走神经背侧运动核和下橄榄核；小脑包括分子层、浦肯野细胞层、颗粒层和白质；丘脑包括腹侧、中央区和背侧区；海马包括齿状回、海马角（cornu ammonis, CA）4至1和腔隙层-分子层（stratum lacunosum-moleculare, SLM）；额叶皮层包括白质和灰质。神经病理学标志物（PrP
Sc 沉积、海绵状变性、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生）及选定蛋白表达使用半定量评分系统评估。染色强度和分布通过光学显微镜盲法评估，评分范围0至5分。
蛋白质印迹（Western blot, WB）分析用于在免疫组织化学应用前定性评估抗体反应性，在丘脑冷冻组织上进行，因该区域是瘙痒病病理最一致受累区域之一。组织以10%（w/v）裂解缓冲液匀浆，使用Pierce
TM BCA蛋白测定试剂盒计算蛋白浓度。每样本30 µg总蛋白与2×Laemmli上样缓冲液混合，95°C加热5分钟后上样于Criterion XT预制12% Bis-Tris凝胶。C4样本上样于Criterion TGX预制7.5%凝胶。蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride, PVDF）膜，2%脱脂奶粉TBST封闭1小时后与免疫组织化学用一抗4°C过夜孵育。膜与过氧化物酶结合抗兔IgG二抗室温孵育1小时后，使用ECL Select蛋白质印迹检测试剂显色。
基因表达分析通过RT-qPCR在瘙痒病影响最严重的两个中枢神经系统区域进行：延髓杓状部水平和丘脑。使用RNAlater保存组织以Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒提取总RNA。RNA纯度和浓度通过NanoDrop分光光度计分析。通过260/280和260/230吸光度比值确认RNA纯度，所有样本平均值1.98±0.06。随后以qScript cDNA SuperMix试剂盒将1 µg总RNA反转录为互补DNA（complementary DNA, cDNA）。研究五种目标蛋白编码基因：SYNCRIP、PLD3、CTSD、SPP1和C4。此外，还分析了此前描述作为瘙痒病感染绵羊中枢神经系统样本内参基因的稳定基因：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）和琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A, SDHA）。使用PrimerBLAST和Primer3Plus v3.3.0进行引物设计，确保引物100%基因特异性。RT-qPCR在QuantStudio 5仪器上进行，每个样本三个复孔。使用2
-ΔΔCt 方法分析数据，以健康对照为参考组计算相对表达。
血清生物标志物ELISA分析显示，SYNCRIP血清浓度随疾病进展呈进行性升高，临床前期（40.6±14.6 ng/mL；p值=0.049）和临床期（44.9±15.5 ng/mL；p值=0.006）动物均显著高于健康动物（22±7.6 ng/mL）。CTSD在临前期（6.58±1.72 ng/mL；p值=0.044）和临床期（6.82±0.83 ng/mL；p值=0.006）均显著升高，而健康对照为4.29±1.06 ng/mL。PLD3血清水平呈现独特模式，仅临床前期动物（1.73±0.5 ng/mL）较健康（0.67±0.26 ng/mL；p值=0.025）和临床期（0.65±0.34 ng/mL；p值=0.019）显著增加。SPP1和C4则未显示组间显著差异。
神经病理学特征评估显示，PrP
Sc 免疫染色健康动物阴性，临床绵羊所有中枢神经系统区域显著增加，临床前期在延髓杓状部、小脑、海马和额叶皮层已出现显著蓄积，丘脑呈接近显著的增加。海绵状变性在各区域均显示瘙痒病感染与健康动物间高度显著差异。星形胶质细胞增生在临床期多数区域显著升高，临床前期仅在延髓杓状部较健康绵羊呈接近显著的增加趋势。小胶质细胞增生在临床前期延髓杓状部显著增加，小脑呈接近显著增加，临床期所有区域均显著升高。
SYNCRIP免疫组织化学分析显示，其在神经元呈强烈均一的核内免疫染色模式，核仁始终未染色，同时伴有低强度神经元胞质染色。除神经元定位外，SYNCRIP在胶质细胞中也显示明显染色。半定量分析显示，瘙痒病感染动物延髓杓状部、小脑、丘脑和额叶皮层SYNCRIP较健康对照显著降低。丘脑中所有检查区域、额叶皮层所有区域均显示显著降低。小脑中仅浦肯野细胞显示显著降低，部分浦肯野细胞在瘙痒病感染绵羊中缺乏可检测的SYNCRIP染色。蛋白质印迹分析显示约65 kDa和70 kDa两条带，可能对应不同SYNCRIP亚型。RT-qPCR分析显示临床期瘙痒病感染动物延髓杓状部（p值=0.04）和丘脑（p值=0.036）SYNCRIP信使RNA（messenger RNA, mRNA）显著上调，临床前期丘脑呈现上调趋势。
PLD3免疫反应性检查显示神经元胞质内呈特征性条纹状分布，神经纤维网中可见明显颗粒沉积。延髓杓状部临床前期和临床期动物PLD3沉积较健康对照显著减少。海马中PLD3在临床前期显著降低，临床期恢复至健康动物水平。具体区域分析显示，延髓杓状部迷走神经背侧运动核和海马CA3、CA4区域存在显著差异。丘脑中央区临床前期较健康对照降低。颈脊髓灰质临床期显著降低。蛋白质印迹确认PLD3表达为约42 kDa单一条带。RT-qPCR显示延髓杓状部临床前期动物显著上调（p值=0.036），临床期恢复至健康动物水平；丘脑临床期显著降低（p值=0.044）。
CTSD免疫组织化学分析与PLD3模式类似，神经元胞质条纹状染色，神经纤维网颗粒沉积。部分健康绵羊特定中枢神经系统区域可见胞质内明显颗粒聚集体，可能反映局部溶酶体聚集。半定量分析显示丘脑健康动物免疫反应性最高，依次为临床期和临前期，三组间存在显著差异。延髓杓状部临床前期和临床期所有三个分析核团均较健康动物显著降低。颈脊髓白质健康绵羊染色强度显著高于瘙痒病感染动物。蛋白质印迹显示多条带：约38-40 kDa可能为前原组织蛋白酶D和原组织蛋白酶D，约28 kDa和25 kDa可能分别为活性酶重链和轻链，32 kDa处较淡条带可能为中间切割产物。CTSD基因表达在延髓杓状部临前期（p值=0.024）和临床期（p值=1.38×10
-4 ）均显著上调，丘脑仅显示轻微非显著上调趋势。
SPP1免疫组织化学显示神经元胞质主要为条纹状染色模式，神经纤维网中弥漫丝状染色为主要模式，偶见颗粒沉积。临床期部分绵羊中脑可见包绕神经元的膜旁免疫染色。延髓杓状部瘙痒病感染绵羊SPP1降低，临床前期呈趋势，临床期显著。丘脑临床前期较健康对照显著降低，临床期呈轻微接近显著降低。海马临床期疾病阶段较健康和临床期显著降低，后者恢复至健康对照水平。蛋白质印迹鉴定出约70 kDa、50 kDa和40 kDa三条带，50 kDa带在临床前期和临床期瘙痒病感染动物中呈双带，而健康对照为单带，提示潜在翻译后修饰或差异加工。RT-qPCR显示延髓杓状部临床前期动物SPP1较健康和临床组显著下调，临床期mRNA水平与健康绵羊几乎相当。丘脑临床期较健康对照显著上调（p值=0.033），临床前期呈上调趋势。
C4免疫反应性主要见于神经元胞质，呈明确颗粒模式，神经纤维网中可见较弱弥漫染色。半定量评估显示总体强度较低，评分0-2分。尽管总体免疫反应性水平低，小脑和丘脑仍观察到显著差异。小脑瘙痒病感染动物两期均较健康对照显著降低，分子层、浦肯野细胞层和白质层均见降低，颗粒层染色极弱。丘脑临床前期较健康对照显著降低，临床期呈接近显著降低趋势，仅腹侧区显示统计学显著差异。蛋白质印迹检测所有样本约90 kDa、60 kDa和46 kDa三条带，可能对应C4三条多肽链α、β和γ。RT-qPCR显示临床期动物延髓杓状部C4 mRNA水平较健康对照显著上调约4倍（p值=0.001），丘脑几乎上调上调5倍（p值=0.009），延髓杓状部临前期亦见显著上调。
蛋白表达与朊病毒相关神经病理学的相关性分析显示，在延髓杓状部和丘脑两个瘙痒病影响最严重且免疫组织化学分析差异最显著的中枢神经系统区域，五种蛋白的免疫组织化学半定量评分与关键神经病理学特征进行了相关性评估。延髓杓状部SYNCRIP、PLD3、CTSD和SPP1均与所有神经病理学特征呈显著负相关，表明较低蛋白水平与更严重朊病毒相关神经病理学相关。丘脑中SYNCRIP与所有神经病理学标志物均呈最强且最显著的负相关。PLD3也与PrP
Sc 和海绵状变性显著相关，但与神经胶质细胞增生无显著关联。蛋白间相关性方面，PLD3和SPP1在两区域均呈显著正相关。C4在两分析区域未与神经病理学特征相关，但在小脑行相关性分析时，其蛋白水平与神经病理学特征显著相关。
讨论部分指出，使用天然瘙痒病感染绵羊作为朊病毒病的临床前期模型，本研究为五种先前经脑脊液验证的蛋白质的诊断潜力提供了新证据，通过探索它们在血清中的浓度、在中枢神经系统的表达及其与朊病毒神经病理学的关系。研究最显著的发现是SYNCRIP、PLD3和CTSD在瘙痒病临床前期血清水平显著升高，强化了这些蛋白质作为早期易获取诊断生物标志物的潜力，凸显血清作为早期疾病检测有前景的外周体液。免疫组织化学和RT-qPCR揭示了蛋白和基因表达的显著改变，多数情况下在临床症状出现前即已存在，特别是在延髓杓状部和丘脑两个瘙痒病关键受累区域。这些变化与神经病理学特征强相关，强化了其在疾病进展中的潜在作用。
尽管SYNCRIP在RNA代谢中有明确作用，但关于其在神经退行性疾病中的研究仍然稀少，特别是在朊病毒病中。血清中显著升高的SYNCRIP为朊病毒病中首个易获取生物标志物证据。在中枢神经系统的研究也首次提供了SYNCRIP在天然瘙痒病不同区域蛋白和基因表达水平失调的证据，临床前期即检测到变化。SYNCRIP免疫染色在延髓杓状部、丘脑和额叶皮层减少，浦肯野细胞明显丢失，提示其在共济失调中的潜在作用。这与Bakkar等人在ALS患者小脑中SYNCRIP改变的研究形成呼应，尽管该研究中蛋白水平升高而非降低。WB显示的两条带可能对应不同SYNCRIP亚型或高度同源的异质性核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNP）家族成员如hnRNP R。
PLD3和CTSD作为参与蛋白降解和凋亡的溶酶体蛋白，在神经退行性变中起关键作用。两者在瘙痒病临床前期血清均显示显著改变，PLD3在临床期恢复至基线，与CTSD在脑脊液中先前观察到的双峰模式相似。这些发现提示这些溶酶体蛋白在外周体液中可能具有复杂且互补的调控机制。两者在丘脑的显著相关性及其相似免疫染色模式提示对朊病毒感染和神经退行性变的共同反应。PLD3可能在临床前期神经元应激时上调，当溶酶体功能障碍加重时补偿机制难以维持。CTSD mRNA在延髓杓状部随疾病进展进行性显著增加，与其在瘙痒病感染小鼠和sCJD病例中的上调一致，可能是对低蛋白水平的代偿机制。
SPP1和C4均在神经炎症中发挥关键作用，参与免疫信号和突触修饰。与脑脊液中显著变化不同，血清中SPP1和C4浓度未显示显著差异，这可能归因于这些蛋白的系统性质。基因表达分析显示SPP1在临床期丘脑上调，尽管延髓杓状部早期下调；C4 mRNA在临床期两区域均显著增加，延髓杓状部甚至临床前期即显著。然而蛋白水平两者在中枢神经系统均降低，与此前部分报道不同，可能提示蛋白从神经元释放或补体消耗。
五种蛋白表达与神经病理学标志物的强显著相关性，特别是在延髓杓状部，提示这些蛋白可能在早期朊病毒病理中尤为重要，因延髓杓状部是天然瘙痒病PrP
Sc 蓄积的主要部位之一。
研究结论指出，研究发现强调了SYNCRIP、PLD3和CTSD作为朊病毒病临床前期易获取诊断生物标志物的有前景作用，在血清等高度可获取的体液中，补充了此前脑脊液中获得的证据。此外，所有五种分析蛋白（SYNCRIP、PLD3、CTSD、SPP1和C4）在中枢神经系统中均表现出跨疾病阶段的显著表达差异，与朊病毒诱导的神经病理学密切相关，进一步支持了它们在疾病进展中的相关性。未来研究有必要验证这些结果，并探索这些蛋白在朊病毒病及其他神经退行性疾病中的潜在预后和治疗意义。
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