研究人员研究了具有抗氧化性能的血红蛋白（Hemoglobin, Hb）类氧载体（Hemoglobin-based Oxygen Carrier, HBOC），用作无法获得红细胞（Red Blood Cell, RBC）时失血性休克的治疗药物。为减轻失血性休克复苏后观察到的氧化损伤，研究人员探究了赋予HBOC抗氧化性能的不同技术。在前期工作中，研究人员研究了用聚多巴胺（Polydopamine, PDA）包被Hb，并证明PDA包被的Hb在保留氧转运性能的同时具有抗氧化性能。由于PDA包被层可生物降解且循环中的无细胞Hb具有毒性，本研究中对张力态（Tense, T-）和松弛态（Relaxed, R-）聚合人血红蛋白（Polymerized Human Hb, PolyHb）进行PDA包被。与前期对一氧化碳（Carbon Monoxide, CO）结合人Hb的PDA包被研究相似，T-和R-态PolyHb的CO结合显著降低了PDA包被PolyHb的高铁血红蛋白（Methemoglobin, metHb）形成。PDA包被PolyHb通过还原力、自由基清除、亚铁态氧化（ferryl oxidation）及过氧化氢酶（Catalase）活性测定显示出增强的抗氧化性能。T-态PolyHb在PDA包被后氧转运性质有中度改变，T-和R-态PolyHb在PDA包被后自氧化速率均升高。与原始PolyHb相比，两种PDA包被PolyHb流体动力学直径略有增加，热稳定性中度降低。T-和R-态PDA包被PolyHb有望作为具抗氧化性能的潜在氧载体，但需进一步优化以限制氧转运性质的变化。
论文解读：具有抗氧化性能的聚多巴胺包被聚合血红蛋白类氧载体研究
研究背景与意义
红细胞（Red Blood Cell, RBC）是输血金标准，但存在体外保存期短（42天）、依赖献血率及在自然灾害、战区、偏远地区不易获取等局限。血红蛋白类氧载体（Hemoglobin-based Oxygen Carrier, HBOC）旨在克服上述限制。其中聚合血红蛋白（Polymerized Hb, PolyHb）经戊二醛交联后分子量＞500 kDa者已在动物模型中显示安全性与有效性，但游离无细胞Hb及＜500 kDa低分子量组分可致全身高血压、肾损伤、高铁血红蛋白血症及心肌梗死，且Hb血红素基团的氧化反应产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）可导致脂质过氧化、DNA损伤及细胞死亡。前期研究表明聚多巴胺（Polydopamine, PDA）包被天然人Hb（human Hb, hHb）可赋予抗氧化性并保留携氧功能，但因PDA可生物降解，包被层降解释放有毒的无细胞hHb，故本研究选用已在动物模型验证安全性且分子量＞500 kDa的T-态（Tense state, 低氧亲和力，适于失血性休克复苏）与R-态（Relaxed state, 高氧亲和力，适于缺氧肿瘤微环境氧合）PolyHb进行PDA包被，探究其能否兼具抗氧化保护与氧运载功能。该论文发表于Journal of Materials Chemistry B。
主要关键技术方法
研究人员从过期人RBC中经切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）纯化hHb，以戊二醛为交联剂分别制备T-态与R-态PolyHb（MW 500 kDa～0.2 μm），经0.2 μm及500 kDa膜过滤纯化。PolyHb预先与CO结合（CO-locking）后用多巴胺盐酸盐在Tris缓冲液（pH 8.5）中于室温氧化聚合原位包被PDA，再经TFF去除未反应多巴胺并置换至生理pH，产物经紫外光解（photolysis）去除CO（CO-unlocking）。以非CO结合组作对照。表征包括：氰化高铁血红蛋白法测metHb含量；TFF渗透液中多巴胺吸光度定量计算PDA包被量；动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测流体动力学直径与多分散指数（Polydispersity Index, PDI）；SDS-PAGE分析聚合完整性；氧平衡曲线（Oxygen Equilibrium Curve, OEC）测P50与Hill系数（n）；停流光谱（Stopped-flow Spectroscopy）测氧卸载速率常数（kO2,off）及结合珠蛋白（Haptoglobin, Hp）结合速率常数（kHp–Hb）；37℃孵育监测630 nm吸光度得自氧化速率常数（kauto-ox）；铁离子还原抗氧化能力（Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP）法、ABTS自由基清除实验评估抗氧化；过氧化氢介导氧化（ferryl Hb/sulfHb形成）及过氧化氢酶活性评估对H2O2耐受；圆二色谱（Circular Dichroism, CD）远紫外与近紫外区分析二级与三级结构；变温CD测熔解温度（Tm）。
研究结果
PolyHb合成与纯化（PolyHb synthesis and purification）
研究人员按文献方法合成并纯化T-态与R-态PolyHb，T-态metHb含量为4.4±0.0%，R-态为1.3±0.1%。
PDA–PolyHb合成与纯化（PDA–PolyHb synthesis and purification）
PDA包被采用同时加入CO结合PolyHb与多巴胺于pH 8.5 Tris缓冲液、搅拌1 h后经TFF纯化。未用CO结合时PDA–PolyHb-T与PDA–PolyHb-R之metHb分别为18.7±1.9%与8.3±0.9%；先用CO结合再光解脱CO后分别降至6.4±0.2%（p<0.001）与4.8±0.8%（p<0.01），证实CO结合显著减少PDA包被过程中metHb生成。
聚多巴胺包被量定量（Quantification of dopamine in PDA coating）
PDA–PolyHb-T与PDA–PolyHb-R中多巴胺负载量分别为39.7±10.7 mg/g Hb与41.7±9.9 mg/g Hb，二者无显著差异（p>0.05）。
动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）
PolyHb-T流体动力学直径为28.1±2.7 nm，PDA–PolyHb-T增至44.9±7.0 nm（p<0.05）；PolyHb-R为17.2±0.5 nm，PDA–PolyHb-R为19.1±0.8 nm（p<0.05）。PDI均无显著变化，表明PDA包被增加粒径但未明显改变粒度分布宽度，且产物经0.2 μm过滤符合避免网状内皮系统（Reticuloendothelial System, RES）快速清除的尺寸要求。
SDS-PAGE
未处理与加二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）变性条件下，PolyHb-T/R及其PDA包被产物均显示>250 kDa主带（聚合种）及微量~16 kDa条带（α/β亚基部分解离）与~30–32 kDa条带（残留碳酸酐酶），PDA包被未引起聚合体进一步解离，证实聚合结构完整。
氧平衡曲线（Oxygen equilibrium curve, OEC）
PolyHb-T之P50为34.3±2.1 mmHg，PDA包被后显著降至14.5±2.3 mmHg（氧亲和力升高，p<0.001）；PolyHb-R之P50为2.6±0.1 mmHg，PDA包被后略升至3.2±0.3 mmHg（p<0.05）。Hill系数均≈1.0且PDA包被前后无显著变化（聚合交联已消除协同性）。说明PDA对T-态氧亲和力影响较明显，对R-态影响较小。
氧卸载动力学（Oxygen offloading kinetics）
PolyHb-T之kO2,off为36.5±0.2 s−1，PDA包被后降至24.4±1.6 s−1（p<0.001）；PolyHb-R为14.1±0.4 s−1，PDA包被后为15.2±0.7 s−1（无显著差异），与P50变化趋势一致。
自氧化动力学（Auto-oxidation kinetics）
PolyHb-T呈单相除自氧化（kauto-ox=0.0191±0.0004 h−1），PDA–PolyHb-T呈双相——快相0.0848±0.0095 h−1（升高，p<0.01）、慢相0.0164±0.0019 h−1（与未包被无差异）。PolyHb-R为0.0072±0.0006 h−1，PDA–PolyHb-R快相0.0201±0.0003 h−1、慢相0.0094±0.0002 h−1。PDA包被使两态PolyHb自氧化加快（快相组分），但增幅低于hHb经相同PDA包被者。
结合珠蛋白结合动力学（Haptoglobin binding kinetics）
PolyHb-T与PDA–PolyHb-T之kHp–Hb分别为0.0058±0.0007 μM−1s−1与0.0048±0.0004 μM−1s−1；PolyHb-R与PDA–PolyHb-R分别为0.0040±0.0001 μM−1s−1与0.0036±0.0002 μM−1s−1；均无显著差异，聚合物空间位阻使Hp结合远低于天然hHb（~0.15 μM−1s−1），PDA包被未额外影响Hp结合。
FRAP assay（Ferric reducing antioxidant power assay）
PolyHb-T FRAP值为10.4±0.3 μM µg−1，PDA–PolyHb-T升至32.4±1.3 μM µg−1（p<0.001）；PolyHb-R由9.3±0.5 μM µg−1升至21.3±1.5 μM µg−1（p<0.001），证实PDA赋予还原能力。
ABTS自由基清除实验（ABTS radical scavenging assay）
PolyHb-T清除活性由1.22±0.07% µg−1升至3.05±0.12% µg−1（p<0.001），PolyHb-R由1.06±0.07% µg−1升至2.26±0.12% µg−1（p<0.001），归因于PDA醌/邻苯二酚基团电子转移能力。
过氧化氢介导氧化（Hydrogen peroxide mediated oxidation / ferryl Hb formation assay）
PolyHb-T经H2O2诱导生成sulfHb 13.0±0.0 μM，PDA–PolyHb-T降至3.8±0.4 μM（p<0.001）；PolyHb-R本身sulfHb生成极低（1.3±0.1 μM），PDA包被后无显著变化（1.3±0.0 μM），与其高氧亲和力抑制Fe2+氧化相关。
过氧化氢酶活性（Catalase activity assay）
PolyHb-T活性由3.6±0.5 U/mL升至5.2±0.4 U/mL（p<0.05）；PolyHb-R由21.4±2.1 U/mL变为22.6±0.8 U/mL（无显著差异），与sulfHb结果互为印证——高过氧化氢酶活性对应低sulfHb形成。
圆二色谱（Circular dichroism spectroscopy）
远紫外CD：所有样品具典型α螺旋特征（208 nm与222 nm负峰），PDA–PolyHb-T在222 nm摩尔椭圆率较PolyHb-T显著降低（p<0.05），提示轻微二级结构扰动；PDA–PolyHb-R与PolyHb-R及hHb与PDA–hHb间无显著差异。近紫外CD：420 nm（血红素口袋环境）各组均无显著差异；260 nm PDA–PolyHb-T与PDA–PolyHb-R较各自前体略降（p<0.001/ p<0.01），提示芳香残基微环境轻微改变但血红素口袋基本完整。
热稳定性（Thermal stability）
PolyHb-T之Tm=73.9±0.7℃，PDA–PolyHb-T降至71.3±0.8℃（p<0.05）；PolyHb-R之Tm=78.1±1.3℃，PDA–PolyHb-R为76.0±1.4℃（无显著差异）；聚合交联提升hHb热稳定性，PDA包被致T-态PolyHb轻微降低，R-态PolyHb保持稳定。
讨论与结论总结
讨论指出CO结合保护heme Fe2+减少PDA氧化过程中metHb形成；PDA增加流体动力学直径源于包被层厚度；PDA对氧亲和力影响差异可能与T/R构象不同导致PDA或多巴胺与heme口袋作用方式不同有关；FRAP与ABTS升高源于PDA氧化还原活性基团；R-态固有高氧亲和力使其抗H2O2氧化强故PDA包被改善不显著；Hp结合因聚合体空间位阻本已很低且PDA未进一步阻碍；CD与热稳定性结果显示二级/三级结构总体保留，R-态PolyHb对PDA包被的结构扰动更小。
结论（翻译）
本研究通过PDA包被成功赋予T-态与R-态PolyHb抗氧化性能，在实现O2转运的同时提供抗氧化应激保护。PDA包被后T-与R-态PolyHb之FRAP与ABTS自由基清除能力均升高，T-态PolyHb催化酶活性显著提升且ferryl Hb形成减少，R-态PolyHb因本身已有高抗氧化保护未见PDA包被引起显著改变。R-态PolyHb保留氧转运特征，T-态PolyHb P50显著下降（氧亲和力升高）且氧卸载速率降低。两态PolyHb自氧化速率在PDA包被后升高但增幅小于hHb经同等PDA包被。PDA包被使两态PolyHb流体动力学直径增大但不影响多分散性，SDS-PAGE证实未诱发聚合体解离、聚合结构完整。PDA包被维持了两态PolyHb之α螺旋与三级结构，T-态PolyHb有轻微改变。聚合提高热稳定性，PDA修饰致T-态PolyHb热稳定性轻微降低而R-态PolyHb无显著影响。综上，PDA包被T-与R-态PolyHb具增强抗氧化能力、结构稳定性及氧运载功能，显示其作为下一代HBOC用于缺氧状况与失血性休克治疗的潜力，但仍需优化以减小对T-态PolyHb氧转运性质的影响。
