呋虫胺（DINO），一种广泛使用的新烟碱类杀虫剂，因其环境风险而受到显著关注。尽管DINO在环境中被代谢，但其具体的毒理学风险仍不清楚。在本研究中，研究人员旨在确定DINO及其代谢物2-硝基-1-(四氢-3-呋喃基甲基)胍（FNG）、1-甲基-3-(四氢-3-呋喃基甲基)胍（DN）、1-甲基-3-(四氢-3-呋喃基甲基)-脲（UF）和N-氨基呋虫胺（NAD）对青鳉（Oryzias latipes）胚胎发育的影响，并通过纳秒脉冲电场（nsPEF）技术将其导入。在1和2 mM浓度的DINO及其代谢物暴露下，青鳉早期发育阶段未观察到导致死亡的急性毒性；然而，部分幼虫在孵化后出现畸形，表明DINO及其代谢物产生了发育效应。所有处理组中约10%的幼虫在孵化后畸形，其中2 mM NAD处理组观察到显著差异。转录组测序揭示，神经活性配体–受体相互作用通路在DINO诱导的发育毒性中发挥重要作用。此外，研究人员构建了青鳉α4β2烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的计算机模拟同源模型。分子对接模拟显示，DINO代谢物能稳定结合nAChR。DINO与青鳉α4β2 nAChR的相互作用潜能顺序为：NAD > DINO > DN > FNG > UF。总体而言，研究人员的研究结果提供了关于DINO及其代谢物在鱼类对新烟碱类化合物发育毒性反应中生物学作用的基础数据。
新烟碱类杀虫剂是全世界使用最广泛的杀虫剂之一，约占全球杀虫剂市场的27%。由于它们对昆虫烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的激动作用而对脊椎动物急性毒性较低，曾被认为对人类和其他脊椎动物风险较低。然而，其在水、食物和环境中的普遍检出，尤其是在地表水和人体尿液中的残留，引发了对其生态毒理效应的担忧。呋虫胺（DINO）是一种非氯化新烟碱类化合物，在日本广泛使用，在河水中检出率超过90%。DINO在环境中相对稳定，主要通过光解和微生物活动降解，产生主要代谢物FNG、DN和UF。已有研究在植物、水、土壤和哺乳动物中检测到这些代谢物，且其对土壤无脊椎动物的毒性较高。然而，关于DINO及其代谢物对鱼类早期发育阶段的具体毒性作用尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在利用纳秒脉冲电场（nsPEF）技术将DINO及其四种代谢物（FNG、DN、UF和NAD）导入青鳉受精卵，评估其对胚胎发育的影响，并通过转录组分析和计算机模拟分子对接探讨其分子机制。研究成果发表于《Toxicology Reports》。
关键技术方法方面，研究人员使用了以下主要技术：1）纳秒脉冲电场（nsPEF）技术，用于将DINO及其代谢物高效导入青鳉受精卵内，通过施加高压脉冲暂时改变卵膜通透性；2）表型观察，利用数字显微镜记录每日发育异常、死亡率、孵化时间和畸形情况；3）超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）系统测量导入的DINO浓度；4）RNA测序（RNA-seq）分析，对处理后6天的青鳉胚胎进行转录组测序，并通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析鉴定差异表达基因（DEGs）涉及的信号通路；5）计算机模拟同源建模和分子对接，以Lymnaea stagnalis乙酰胆碱结合蛋白与去硝基-吡虫啉的复合晶体结构（PDB ID: 3WTN）为模板，构建青鳉α4β2 nAChR同源模型，并使用诱导契合对接程序计算DINO及其代谢物的结合自由能（S-score）。样本来源：青鳉鱼购自日本国立环境研究所（茨城县）。
研究结果分为四个部分：
3.1 DINO在青鳉卵中的浓度
通过UPLC-MS测量，未施加nsPEF的卵中DINO浓度为137 μM，而施加nsPEF后浓度为448 μM，确认nsPEF技术成功将DINO导入卵内。
3.2 青鳉异常、孵化和畸形评估
所有处理组均未观察到导致死亡的急性毒性。血栓发生率和平均孵化日数在对照组和处理组间无显著差异。但孵化后畸形率在所有处理组中约为10%，其中2 mM NAD处理组与对照组相比差异显著（p<0.05）；畸形主要表现为侧背、纵向和尾部弯曲，未发现化学特异性畸形。
3.3 DINO暴露对青鳉胚胎转录组的影响
RNA-seq分析鉴定出DINO、UF、FNG、DN和NAD处理组分别有3767、5511、3994、8474和9065个差异表达基因。KEGG通路分析显示，神经活性配体–受体相互作用通路在所有处理组中均显著富集；细胞因子-细胞因子受体相互作用通路在除DN外的所有组中常见改变；类固醇激素生物合成、肠道免疫网络和视黄醇代谢在DINO和NAD组中改变；而代谢途径、类固醇生物合成、初级胆汁酸生物合成、嘧啶代谢、谷胱甘肽代谢、GPI锚生物合成和脂肪细胞因子信号通路仅在DN组中改变。
3.4 nAChR与DINO及其代谢物的相互作用
构建的青鳉α4β2 nAChR同源模型配体结合腔体积为142 Å
3。分子对接计算得到DINO、UF、FNG、NAD和DN的S-score分别为-6.854、-6.004、-6.602、-6.860和-6.644 kcal/mol。结合方式分析显示，DINO与Val130、Leu140主链和Cys154侧链形成氢键；NAD与Trp110主链和Cys154侧链形成氢键，且S-score最低（结合最强）；UF与Trp110和Cys153形成氢键；FNG与Val130和Leu140形成氢键；DN仅与Cys154形成氢键；DINO和FNG还通过CH-π相互作用与Trp110和Tyr158结合。相互作用潜能顺序为NAD > DINO > DN > FNG > UF。
讨论部分总结：研究利用nsPEF技术成功将DINO及其代谢物导入青鳉胚胎，确认了该技术的可靠性。表型分析显示，DINO和代谢物仅引起弱发育效应（约10%的孵化后畸形），但NAD组畸形率显著升高，且未观察到化学特异性畸形，提示其毒性可能与所有化合物共有的（四氢-3-呋喃基）-甲基基团有关。转录组分析表明，神经活性配体–受体相互作用通路在DINO及其代谢物的发育毒性中起关键作用，该通路涉及神经递质受体，其紊乱可导致鱼类发育毒性；DN组特有的代谢通路富集可能反映其不同的作用机制。计算机模拟表明，DINO代谢物能稳定结合青鳉α4β2 nAChR，结合能力顺序与致畸趋势一致（UF除外），说明高亲和力化合物更可能影响胚胎发育。
研究结论部分可翻译为：总之，在暴露于DINO及其代谢物的青鳉早期发育阶段未检测到急性毒性；然而，部分幼虫在孵化后畸形。转录组测序揭示神经活性配体–受体相互作用在DINO诱导的发育毒性中发挥重要作用。此外，计算机模拟分析显示DINO代谢物能结合青鳉nAChR。这些代谢物的致畸性几乎与DINO相同，表明本研究使用的四种代谢物的毒性并未因代谢而改变。本研究提供了关于DINO代谢物对鱼类新烟碱类农药发育毒性反应不良影响的基础数据。未来需要阐明DINO代谢物对其他水生生物的毒性风险。
