利用胞外DNA实现exatecan精准递送：新型抗体偶联药物在癌症治疗中的突破

时间：2025年10月14日

来源：Molecular Cancer

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本研究针对当前抗体偶联药物（ADC）面临的肿瘤靶向性不足、内化效率低及难以抵达特殊病灶（如脑肿瘤）等局限，开发了一种基于抗胞外DNA（exDNA）抗体V66的新型ADC——V66-exatecan。该药物通过结合肿瘤微环境中的exDNA和癌细胞高表达的ENT2转运蛋白，实现核内靶向递送exatecan（TOP1抑制剂），在多种癌症模型（包括三阴性乳腺癌和BRCA缺陷型髓母细胞瘤）中诱导显著DNA损伤反应（DDR）、旁观者杀伤及肿瘤完全消退，且无显著毒性。该研究为克服传统ADC局限性提供了新策略，尤其适用于DNA修复缺陷型肿瘤和血脑屏障穿透难题的治疗。

在癌症治疗领域，抗体偶联药物（ADC）被誉为“魔法子弹”，旨在通过抗体特异性将高效毒素精准送达肿瘤细胞。然而，现有ADC仍面临三大瓶颈：其一，缺乏仅在肿瘤细胞高表达且健康组织几乎不存在的靶点；其二，即使抗体结合靶点，内化效率低下，仅约1%–2%的注射剂量最终进入肿瘤细胞；其三，对于血脑屏障（BBB）保护的颅内肿瘤或DNA修复缺陷型肿瘤，药物递送尤为困难。

为解决这些难题，耶鲁大学Peter M. Glazer团队另辟蹊径，将目光投向肿瘤微环境中一种富集却常被忽视的成分——胞外DNA（exDNA）。当肿瘤细胞因坏死或DNA损伤释放核内物质时，exDNA在微环境中累积，成为理想靶点。受系统性红斑狼疮患者体内可穿透细胞核的自身抗体3E10的启发，研究者对其人源化改造，得到高亲和力exDNA抗体V66，并通过可切割连接子将它与拓扑异构酶-I（TOP1）抑制剂exatecan偶联，构建了新型ADC药物V66-exatecan。

该ADC的创新机制在于“双靶向”：V66首先结合肿瘤区域的exDNA，随后通过癌细胞高表达的平衡型核苷转运蛋白2（ENT2）直接穿透细胞膜，并进入细胞核，绕过了传统ADC的内吞-溶酶体途径。这一过程不仅提升了靶向特异性，还实现了毒素的核内精准投递。

关键技术方法

研究通过以下核心实验验证V66-exatecan的效能：

1.
体内外靶向验证：利用荧光标记抗体在荷瘤小鼠模型中评估V66的肿瘤富集与核定位能力；
2.
ADC合成与表征：采用半胱氨酸偶联技术构建DAR（药物-抗体比）为8的V66-exatecan，并通过HPLC和质谱确认纯度；
3.
细胞活力与机制研究：跨多个癌细胞系（如MDA-MB-231、DLD1 BRCA2^-/-）分析ADC的EC₅₀、DDR激活（γH2AX、pATM）及TOP1降解；
4.
体内药效与毒性评估：在异种移植模型（三阴性乳腺癌、BRCA缺陷型结直肠癌）和自发髓母细胞瘤转基因小鼠中测试肿瘤抑制、生存期及血液学、肝肾毒性。

研究结果

1. V66抗体在体内实现肿瘤选择性积累与核定位

通过静脉注射荧光标记V66至DLD1肿瘤小鼠，24小时后显像显示抗体在肿瘤中特异性富集，而在健康组织中分布极低（除肝脏因清除途径有信号）。细胞分馏实验证实V66可穿透肿瘤细胞并主要定位于核内，且该过程依赖ENT2转运蛋白，而非经典内吞途径。

2. V66-exatecan ADC诱导DNA损伤并高效杀伤肿瘤细胞

V66-exatecan在多种癌细胞系中表现出纳摩尔级EC₅₀值（如MDA-MB-231为6.7 nM），而对正常小鼠原代成纤维细胞无毒性。Western blot显示其能时间依赖性激活DDR信号（γH2AX↑、pATM↑）并降解TOP1。在三阴性乳腺癌模型中，ADC显著抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期（中位生存期从56天增至98天），且无体重下降或器官毒性。

3. BRCA缺陷肿瘤对V66-exatecan敏感性显著增强

在BRCA2敲除（KO）的DLD1细胞中，ADC的EC₅₀较野生型（WT）降低10倍。机制上，BRCA缺陷细胞因持续DNA损伤释放更多exDNA，促进V66抗体内化。体内实验显示，DLD1 BRCA2^-/-移植瘤经V66-exatecan治疗后40%完全消退，中位生存期延长至233天（对照组54天）。

4. exDNA积累促进ADC内化，辐射“预激”增强疗效

通过核酸酶处理、辐射诱导DNA损伤及Sytox染色实验，证实exDNA是V66内化的关键介质。在荷瘤小鼠中，预先局部照射肿瘤（10 Gy）可显著提升V66的肿瘤积累，凸显“DNA损伤- exDNA释放-抗体富集”的正反馈循环。

5. V66-exatecan穿透血脑屏障治疗髓母细胞瘤

在Brca1^-/-;Trp53^-/-和Brca2^-/-;Trp53^-/-自发髓母细胞瘤模型中，ADC通过BBB并在脑肿瘤中富集，使中位生存期分别从85天延至110天、88天延至157天。体外实验显示髓母细胞瘤细胞对ADC高度敏感（EC₅₀≈20 nM）。

6. 毒性研究显示优异安全性

单剂量递增实验（5–200 mg/kg）中，仅200 mg/kg组出现严重毒性（体重下降），而≤100 mg/kg均无显著血液学、肝肾或骨髓抑制。长期重复给药亦未发现器质性损伤。

结论与意义

V66-exatecan代表了一类突破性的ADC平台，其通过exDNA-ENT2双靶向机制解决了传统ADC的靶点局限性和递送效率低下的核心问题。该药物在DNA修复缺陷（如BRCA1/2突变）肿瘤中表现尤为突出，并能有效穿透血脑屏障，为三阴性乳腺癌、髓母细胞瘤等难治性肿瘤提供了新策略。其卓越的安全性（治疗窗宽）和诱导肿瘤完全消退的潜力，支持其进入临床转化阶段，有望成为下一代精准癌症治疗的重要候选药物。