适度跑步机运动通过改变血浆外泌体RNA含量延缓帕金森病大鼠模型多巴胺能神经元丢失

本研究揭示了适度慢性跑步机运动在帕金森病（PD）大鼠模型中的神经保护作用，发现其能显著延缓黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元（DN）丢失，并首次系统鉴定了运动大鼠血浆外泌体中27种上调RNA（包括具有明确神经保护潜力的NPY、Rgs4、Mt-atp6等mRNA）。该研究为理解运动介导的器官间通讯（特别是肌肉-脑轴通过外泌体"exerkines"的信号传递）提供了新机制，为开发基于外泌体的PD神经保护疗法奠定了理论基础。

摘要

运动已被报道可改善帕金森病患者的预后，但其确切的生物学机制仍未完全明了。本研究旨在确定慢性适度跑步机运动是否能在临床前PD模型中预防多巴胺能神经元丢失和路易体样包涵体负荷。该研究还试图鉴定具有诱导神经保护性大脑适应潜力的血浆外泌体结合的"运动因子"。运动的益处被认为部分是通过运动期间丰富的称为运动因子的核酸、脂质和肽来实现的。这些运动因子可以诱导细胞特异性的运动适应，最终实现神经保护。无膜运动因子在血液中易降解，可能无法有效穿过血脑屏障以诱导大脑对运动的适应，限制了它们的器官间信号传递潜力。这使我们假设运动因子，特别是生物活性RNA，可能在运动期间被选择性包装进外泌体并释放到血浆中。外泌体是小的细胞外囊泡，由细胞选择性包装和释放，其组成在静息、损伤和疾病期间以及响应运动时可能存在重要差异。外泌体已被证明在器官间通讯中起主要作用。研究发现慢性运动能为黑质致密部的多巴胺能神经元提供神经保护，而不影响黑质或纹状体中的路易体样包涵体负荷。从年龄匹配的运动和非PD久坐大鼠中分离血浆外泌体RNA并进行测序。我们报告了27种在运动者外泌体中上调的独特RNA，其中3种mRNA具有明确的神经保护潜力。

总结

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  已知运动可减缓PD进展，但其确切机制尚未完全明了。
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  我们表明，持续1个月的适度运动显著减缓了临床前大鼠模型中PD的进展。
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  我们鉴定了在进行适度运动的大鼠血浆外泌体中增加的RNA。外泌体是小的、选择性包装的细胞外微囊泡，是已知的器官间通讯介质。
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  它们携带生物活性分子，如我们鉴定的RNA，这些分子具有诱导运动神经保护益处的潜力。
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  这些外泌体也可能促进运动在其他神经系统疾病中的益处。

1 引言

PD是一种常见的神经退行性运动障碍，影响数百万人，具有公认的运动缺陷，以及日益受到关注的相关非运动症状。PD的遗传和环境风险因素也已被确定。PD常见的遗传风险因素包括富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因的功能获得性突变和编码α-突触核蛋白（SNCA）基因的重复或突变。迄今为止，总共已鉴定出23个风险基因（PARK 1-23），其中一些具有多个遗传变异。然而，即使是最常见的PD致病突变，也仅占所有PD病例的1%–9%，具体取决于人群。相比之下，PD的环境风险因素更为常见，包括创伤性脑损伤以及接触除草剂、杀虫剂和挥发性有毒物质。无论病因如何，PD治疗仍然局限于使用多巴胺能激动剂和深部脑刺激进行症状管理。虽然这些治疗能有效控制症状，但并不能阻止或减缓PD的进展。

长期或慢性适度运动的益处与PD患者改善的临床结果密切相关。在6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的半帕金森病大鼠模型中，适度运动减轻了变性。在腺相关病毒-α-突触核蛋白（AAV-α-syn）PD大鼠模型中报道了类似的效果。然而，真正的路易体样包涵体形成（PD的典型特征）以及进行性而非急性的神经变性，连同病理的进行性跨突触传播，在纤维模型PD中可见。这些人类PD病理的方面在评估动物模型中运动的益处时非常重要。通过颅内注射预形成的α-突触核蛋白纤维（PFF）可以实现伴随α-突触核蛋白病理跨突触传播的进行性神经变性。使用PD的PFF模型，我们想评估运动对多巴胺能神经元进行性丢失和路易体样包涵体负荷的影响。此外，我们想鉴定在运动期间丰富的具有诱导神经保护适应潜力的运动因子。

几条证据表明，血液中的循环因子可能促进神经恢复。年轻和年老动物之间的联体共生已被证明能改善年老动物的行为功能。在这些研究中，年轻和年老动物的循环系统连接一段时间，并显示出在各种疾病状态下的改善。血液因子作为神经系统疾病潜在治疗的可行性也在人类中得到证明，将年轻人类供体的血浆输给患有轻度认知障碍的老年接受者。参与改善的因素可能包括运动期间或运动后不久由所有组织释放的运动因子，具有自分泌和旁分泌信号传导的潜力。运动期间释放的具有神经保护潜力的常见自分泌运动因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）和Musclin。对大脑具有内分泌作用的运动因子则更具争议性。例如，鸢尾素（Irisin），一种肌肉衍生的肽，存在于血浆中，具有神经保护特性，但由于未解决的转录问题和检测方法可靠性的问题，其与脑组织的直接联系仍不明确。病毒过表达鸢尾素在PD小鼠模型中显示出神经保护作用，但该研究未解决生理性鸢尾素水平或作用机制的问题。尽管运动的神经保护益处是众所周知且 largely irrefutable，但运动相关益处的分子机制仍未完全明了。更好地理解运动期间的器官间通讯，特别是那些具有神经保护潜力的通讯，可以为未来治疗方法的开发提供信息。

血浆外泌体是小的（< 100 nm）细胞外微囊泡，其货物包括选择性包装的、受保护的免于在血液中酶解的生物活性RNA、蛋白质和脂质。外泌体是器官间通讯的促进者，运动后含量丰富，并且可以很容易地从血液中分离。最近一项人类初步研究表明，健康久坐人类受试者血液中存在的外泌体与运动者的外泌体在其微RNA（micro-RNA）含量上有所不同，这表明那些运动特异性的外泌体可能参与器官间通讯。对血液中能够重编程脑细胞走向再生的神经保护因子的更深入理解将允许开发更特异和更有效的治疗方法。外泌体是内溶酶体途径的产物，在从细胞释放之前被合成并装载货物，然后储存在多泡体（MVB）中。它们可以通过多种方法从各种生物体液中分离，包括血液，例如差速离心和过滤。通常，采用一种以上的分离方法以最大化产量和纯度。外泌体含有膜标记物，可防止其在血液中被吞噬，从而允许长距离分布并到达其他器官。外泌体不会引起强烈的免疫反应，并且已被证明可以轻松穿过血脑屏障（BBB）。公认的外泌体生物标志物包括CD9、CD63和CD81。基于这些研究，我们想确定在临床前PFF PD模型中实现神经保护所需的跑步机运动程度，并鉴定在神经保护水平运动期间释放的外周外泌体RNA含量。目前人类和大鼠文献中缺乏关于慢性运动与久坐对照相比导致的血浆外泌体RNA变化的研究。本研究将鉴定在能够为PD大鼠提供神经保护的适度慢性运动水平下丰富的血浆外泌体RNA。这项研究的结果将扩展我们对具有神经保护潜力的运动适应性变化的理解。

我们假设为期1个月的适度慢性运动将减缓PD的进展，其衡量标准是多巴胺能神经元丢失和路易体负荷。此外，我们假设血浆外泌体RNA货物中将含有具有诱导神经保护性大脑对运动适应潜力的mRNA水平升高。

2 方法

2.1 动物使用

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，9-10周龄，购自Charles River，并根据VA新泽西医疗保健系统机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南进行处理。大鼠单独饲养在标准的18夸脱聚碳酸酯桶中，垫料为bed-o-cob，每周更换一次。房间温度保持在22°C ± 4°C，大鼠保持12小时开灯和12小时关灯的反向光照周期，以便在大鼠活动阶段进行实验。为了在处理和实验期间最大限度地减少压力，大鼠在实验前接受实验员为期一周的适应处理。本研究使用了两个独立的队列。队列1：通过注射PFFs诱导PD，然后进行运动处理和组织学分析；队列2：进行运动处理，然后进行分子生物学分析以确定运动后的外泌体含量。所有大鼠均保持标准的自由进食和饮水饮食。

2.2 重组αSyn PFF合成与注射

为了启动PD样病理，按照Delic等人先前详述的方法，将大鼠麻醉并单侧颅内注射到解剖学右侧SNpc中，注射20 μg PFFs或单体αSyn。单体和PFF由杜克大学医学院的Andrew West博士慷慨提供，并按照Abdelmotilib等人先前描述的方法生成。简而言之，重组小鼠αSyn在大肠杆菌中表达，使用尺寸排阻色谱法和离子交换进行分离和纯化，然后去除内毒素。使用聚集测定法将αSyn聚集成纤维。形成的纤维通过超声处理片段化，并稀释至5 μg/μL。在Bregma坐标为X = 2.5, Y = 5.35–5.5, Z = 7.4–7.5 mm处制作一个钻孔，并在30分钟内以4 μL体积注射。

2.3 运动方案

大鼠被放置在跑步机上，背对实验员。在跑步机上持续监测动物。跑道由有机玻璃外壳隔开，防止大鼠之间互动。运动组进行5分钟10 m/min的热身，然后以20 m/min的速度，无坡度，运动30分钟，每周5天。使用配备有光信号和尾部电击的5通道MazeEngineers跑步机进行运动。久坐对照组在运动期间也在房间内。虽然文献中关于哪种速度能带来最大益处仍不一致，但20 m/min的速度可以耐受长达45分钟，每周5天。在以高于20 m/min的速度跑30分钟时，发现高达50%的损耗。使用20 m/min是因为PD大鼠始终能耐受此速度，且损耗最小（1只大鼠）。

2.4 灌注和组织收集

计划进行免疫组织化学（IHC）的大鼠被深度麻醉，用PBS灌注，然后用4%多聚甲醛（PFA）灌注，随后在4°C下在4% PFA中振荡固定过夜。大脑在30%蔗糖中冷冻保存，并储存在-80°C，如Delic等人先前所述。在最后一次运动后30分钟内，通过左心室心脏穿刺抽血，收集到肝素锂涂层真空管中。为了获得血浆，将血液使用HemoCue StatSpin Express 2离心机以8500 x g离心180秒两次，以去除细胞和细胞碎片。将血浆置于冰上直至外泌体分离的当天。

2.5 统计学

所需的样本量n = 10是基于功效分析（预期sigma = 0.377，效应量 = 1.33，显著性水平0.05，功效 = 80%）通过实验确定的，用于黑质致密部（SNpc）中酪氨酸羟化酶阳性（TH+）神经元的立体学估计。n = 10用于比较纹状体中的TH+纤维密度。所有组织学组有2个对照组（单体，作为手术载体对照，和PFF注射阳性对照）和1个实验组，PFF + 运动。对于像RNA测序这样具有更高灵敏度的分子检测，经实验确定n = 4是足够的。两组：1个久坐对照组和1个运动实验组。使用随机数生成器将大鼠随机分配到每个实验组或对照组。使用普通单因素方差分析（ANOVA）检验来确定SNpc中TH+神经元计数的显著差异。显著性由* p < 0.05和** p < 0.01表示。实心圆点代表单个数据点，红色误差条代表标准差，黑色水平条表示平均值。对于进行了统计分析的数据，图注中现在包含了Tukey多重比较事后检验结果的单因素方差分析；完整的方差分析表和正态性检验包含在补充表S1中。使用Prism for macOS分析和绘制数据。如果大鼠未能完成运动，则被排除在研究之外；在运动的第二天替换了1只大鼠。在研究过程中没有大鼠死亡。

2.6 免疫组织化学

使用冷冻切片机收集40 μm厚的连续切片，黑质部分为1-4，纹状体部分为1-6。切片储存在含有0.1%叠氮化钠的50%甘油中，于-20°C保存。所有用于IHC的组织均在缓冲液（10 mM柠檬酸盐，0.05% Tween-20，pH 6.0）中于37°C振荡进行抗原修复30分钟。使用二抗来源物种的血清进行封闭。关于所有抗体的列表，请参见表1。用于立体学的组织在含有0.6%过氧化氢的甲醇中淬灭，并用针对酪氨酸羟化酶（TH+）的一抗探测多巴胺能神经元。在丝氨酸129位点磷酸化的α-突触核蛋白（pSyn）也以相同方式染色，以可视化路易体样包涵体进行手动计数。TH+和pSyn通过HRP偶联的二抗和Vector Labs的DAB试剂盒染色显示。组织用苏木精对细胞核进行复染。染色的切片安装在Fisherbrand Superfrost载玻片上，干燥，用Permount封片剂覆盖，并盖上盖玻片。对于荧光染色，在抗原修复后进行封闭，无需甲醇淬灭，然后与荧光二抗一起孵育（表1）。荧光切片用Hoechst复染，安装在Superfrost载玻片上，用ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂覆盖并封片。

2.7 多巴胺能神经元的无偏立体学定量

用于计数的切片覆盖整个SNpc，采用1/4抽样，等间距120 μm，在所有计数区域随机放置计数框。保护带高度设置为2 μm。采样网格大小（例如，200 μm）根据需要进行了调整，由于病变大小可变，平均在每个100到200个x-y位置计数约5个物体。计数TH+阳性的DAB染色的多巴胺能神经元和TH-神经元。多巴胺能神经元根据深棕色染色的胞体与非多巴胺能神经元区分开。TH-神经元根据其大尺寸与胶质细胞区分开（图2C），并根据缺乏DAB染色与TH+神经元区分开。

2.8 共聚焦显微镜

使用奥林巴斯Fl