Hd6-Hd2模块通过磷酸化调控氮依赖的水稻花期延迟分子机制

本研究针对水稻生产中氮肥施用导致花期延迟的分子机制不明这一关键问题，通过全基因组关联分析发现光周期开花调控因子Hd6是氮依赖花期表型变异的关键信号组分。研究人员利用近等基因系验证了Hd6-Hd2-Hd1遗传互作网络，首次揭示Hd6通过磷酸化稳定Hd2蛋白，进而拮抗Hd1对成花素基因Hd3a/RFT1的转录激活作用，阐明了氮信号直接整合到光周期开花调控通路的新机制，为水稻育种栽培提供了新策略。

在水稻生产体系中，氮肥管理是影响作物产量和品质的关键农艺措施。有趣的是，农民很早就发现增加氮肥施用会延迟水稻抽穗期，这种氮依赖的花期延迟现象在杂交稻制种中被实际应用，通过调节双亲花期相遇来提高制种效率。然而，这种看似简单的农艺现象背后隐藏着复杂的分子调控机制：氮信号如何被植物感知并整合到开花调控网络中？特别是与光周期通路之间存在怎样的交叉对话？这些问题长期以来悬而未决。

以往研究已知水稻开花主要受光周期调控，Hd1和Ehd1是两个重要的开花促进因子，它们激活成花素基因Hd3a和RFT1的表达。此外，数十个抽穗期(HD)基因构成了复杂的调控网络，其中Hd6编码CK2α蛋白激酶亚基，Hd2编码含CCT结构域的假应答调节蛋白，但Hd6-Hd2模块的生理功能和分子机制仍不清楚。虽然体外实验表明重组Hd6蛋白能磷酸化重组Hd2蛋白，但这一现象在体内的生物学意义及其与环境因子的关联尚未阐明。

为了解开氮信号与开花调控的谜团，日本研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过对149个日本水稻品种在不同氮条件下的抽穗期进行全基因组关联分析(GWAS)，发现染色体3末端的一个显著峰与高氮条件下的花期延迟密切相关。该区域包含Hd6基因，进一步分析表明，只有功能型Hd6等位基因才能介导氮依赖的花期延迟反应。

研究人员利用近等基因系验证了Hd6、Hd2和Hd1之间的遗传上位性相互作用，发现这三个基因的功能等位基因必须同时存在才能表现出氮依赖的花期延迟。分子机制研究表明，氮处理并不影响Hd6转录水平，但会剂量依赖性地增加Hd6蛋白积累。增加的Hd6蛋白通过磷酸化Hd2蛋白的Ser369位点，增强其稳定性，从而强化对Hd1介导的成花素基因表达的抑制作用。

通过双分子荧光互补(BiFC)和体外pull-down实验，研究人员证实了Hd6与Hd2之间的直接物理相互作用，并发现Hd2能够拮抗Hd1对Hd3a启动子CORE2元件的转录激活作用。这种拮抗作用在Hd6存在时进一步增强，形成了氮信号→Hd6蛋白积累→Hd2磷酸化/稳定→拮抗Hd1→抑制成花素基因表达的完整信号通路。

这项研究首次揭示了氮信号通过Hd6-Hd2模块直接调控水稻开花时间的分子机制，为理解营养信号与发育调控的整合提供了新视角，也为未来水稻品种改良和栽培技术创新奠定了理论基础。

主要关键技术方法包括：利用149个日本水稻品种资源进行田间表型鉴定（2016-2017年）；全基因组关联分析(GWAS)检测氮响应数量性状位点；近等基因系(NIL)构建与遗传分析；蛋白质免疫印迹与磷酸化检测（Phos-tag技术）；质谱分析鉴定磷酸化位点；水稻叶肉原生质体瞬时表达与双分子荧光互补(BiFC)实验；RNA测序与差异表达基因分析。

结果

GWAS分析不同氮浓度条件下的抽穗期

为了评估氮肥对开花的影响，研究人员测量了149个粳稻品种在三种氮水平（低、正常、高：0、9和18 kgN/10公亩）下的抽穗期(DTH)。结果显示，64.8%的植株在正常氮条件下比低氮条件下开花延迟，78.3%和82.7%的植株在高氮条件下分别比正常和低氮条件下开花延迟。GWAS分析在高氮条件下检测到染色体3长臂末端的一个显著峰，该区域在低氮与高氮、正常氮与高氮条件的差异分析中同样出现显著峰，但在低氮与正常氮条件的比较中不显著，表明该区域与氮响应开花调控特异性相关。

Hd6是氮响应开花调控的候选基因

通过连锁不平衡(LD)分析，研究人员发现峰值区域包含Hd6基因(LOC_Os03g55389)，该基因编码CK2α。Hd6存在两种单倍型：单倍型A因提前终止密码子而功能缺失，单倍型B功能正常。在所有氮条件下，单倍型A的DTH均短于单倍型B。单倍型B在高氮条件下的DTH长于低氮或正常氮条件，而单倍型A在不同氮条件间无显著差异，表明功能性Hd6等位基因是氮响应开花调控所必需的。

Hd6-Hd2模块受氮影响

由于Hd6和Hd2之间存在已知的遗传相互作用，且本研究显示Hd2与Hd6一样是氮响应开花调控所必需的，研究人员假设氮可能调控Hd6-Hd2模块。研究发现，不同氮浓度不影响内源Hd2表达，但Hd6蛋白通过磷酸化稳定Hd2蛋白。在表达3FLAG-Hd2的转基因植株中，Hd6共表达显著增强3FLAG-Hd2蛋白积累，且这种积累在高氮条件下更为明显。

Hd6与氮浓度的关联

研究发现，只有同时表达Hd6和Hd2的转基因植株(35S:Hd6/Ubq:Ω:3FLAG-Hd2)表现出高氮引起的开花延迟效应。RNA测序分析发现，在高氮条件下，35S:Hd6/Ubq:Ω:3FLAG-Hd2植株中有409个差异表达基因，其中103个下调基因中包含多个开花相关基因，如Ehd1、Hd3a、RFT1等。进一步生化分析表明，CK2抑制剂苯并咪唑能取消3FLAG-Hd2积累，质谱分析鉴定出Hd6对Hd2的Ser369磷酸化位点。

Hd2整合到Hd1依赖的Hd3a表达调控中

鉴于Hd2功能在光周期开花通路中相对于Hd1具有上位性，研究人员分析了这些蛋白间的物理关系。亚细胞定位显示GFP-Hd6、GFP-Hd2和GFP-Hd1均定位于细胞核，其中Hd6富集于核仁。BiFC实验证实Hd6-Hd2和Hd6-Hd1复合物在核内形成，但未检测到Hd2-Hd1直接相互作用。瞬时报告基因实验表明，Hd2能剂量依赖性地拮抗Hd1对CORE2元件的转录激活作用，而Hd6可增强Hd2的这种抑制效应。

讨论与结论

本研究通过多层次的实验证据阐明了氮信号通过Hd6-Hd2模块调控水稻开花时间的分子通路。研究发现，氮诱导的Hd6蛋白积累通过增强Hd2磷酸化和稳定性，进而拮抗Hd1对成花素基因的转录激活，最终延迟开花。

这一发现具有多重意义：首先，它揭示了营养信号与发育调控直接整合的新机制，表明植物能够通过蛋白磷酸化级联反应将氮营养状态信息转化为发育时序的调整。其次，Hd6-Hd2模块作为氮信号与光周期通路的交叉点，使植物能够根据营养状况微调光周期敏感性，这可能是水稻适应不同纬度栽培的重要机制。第三，研究解释了为什么现代水稻品种中常携带hd6和hd1功能缺失等位基因——这可能是在高氮施肥条件下对开花时间进行优化选择的结果。

值得注意的是，虽然本研究聚焦于Hd6-Hd2-Hd1通路，但氮信号调控开花的完整网络可能涉及更多组分。例如，硝酸盐转运蛋白OsNRT1.1A和MYB转录因子Nhd1也被报道参与氮依赖的开花调控，它们与Hd6-Hd2模块之间的关系仍需进一步探索。此外，氮信号如何调控Hd6蛋白积累的具体机制——是否涉及CIPK或MAPK等激酶级联——仍是未来研究的重要方向。

这项研究不仅增进了我们对植物环境适应性机制的理解，也为未来水稻育种提供了新思路。通过调控Hd6-Hd2模块的活性，可能培育出氮肥利用效率更高、花期更适宜的新品种，为实现可持续农业提供基因资源。