基于细胞高通量筛选的单价降解剂发现：机制解析与药物开发新策略

本刊编辑推荐：针对传统小分子抑制剂难以靶向的"不可成药"靶点，研究人员系统探讨了通过无偏倚细胞筛选发现单价蛋白降解剂的新策略。该研究详细阐述了分子胶水降解剂(MGDs)等多种降解机制，建立了HTS兼容的筛选流程，并提出了CRISPR筛选、CETSA®等机制解析技术，为靶向蛋白降解(TPD)领域提供了重要的方法论指导。

在药物研发领域，传统小分子抑制剂面临着难以靶向"不可成药"靶点的重大挑战。这些靶点通常缺乏明确的活性位点，或者其功能依赖于蛋白-蛋白相互作用，使得常规的抑制策略难以奏效。靶向蛋白降解(Targeted Protein Degradation, TPD)技术的出现为这一困境带来了突破性解决方案，其中蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)和分子胶水降解剂(Molecular Glue Degraders, MGDs)等新兴模式备受关注。

然而，当前TPD药物发现主要集中于双功能降解剂，这些分子通常面临口服生物利用度差、中枢神经系统渗透性不佳等药代动力学挑战。相比之下，单价降解剂具有分子量小、类药性好的优势，但其发现过程却充满挑战。传统的理性设计方法需要预先了解靶蛋白和E3连接酶的配体信息，这大大限制了其应用范围。正是在这样的背景下，研究人员开始探索无偏倚细胞筛选策略，希望能够直接从化合物库中发现具有降解活性的单价小分子。

这项发表在《npj Drug Discovery》的研究系统阐述了基于细胞的高通量筛选方法在单价降解剂发现中的应用价值。研究人员指出，无偏倚筛选的最大优势在于能够同时利用细胞内表达的多种E3连接酶和内生性降解途径，为靶蛋白降解提供更多可能性。与传统的理性设计相比，这种方法不依赖于特定的E3连接酶，而是充分利用细胞自身的降解机制，从而有可能发现通过全新机制发挥作用的降解剂。

研究详细阐述了八种不同的细胞降解机制（图1），包括直接作用的分子胶水降解剂、适配体分子胶水降解剂、变构作用降解剂、化合物诱导的靶蛋白多聚化、蛋白-蛋白相互作用破坏、信号通路干扰、亚细胞定位改变以及特异性蛋白去稳定化。每种机制都配有具体的化合物实例，如(S)-ACE-OH通过招募TRIM21连接酶降解核孔蛋白，BI-3802通过诱导BCL6多聚化促进其降解等。

在关键技术方法方面，研究团队重点介绍了适用于降解剂筛选的细胞水平检测技术。这些方法主要包括：基于均相时间分辨荧光(HTRF)的检测系统，利用抗体对靶蛋白进行特异性检测；AlphaScreen^®/AlphaLISA技术，通过供体-受体珠的邻近效应产生信号；HiBiT标记系统，通过小肽标签与LgBiT蛋白的互补重构来定量蛋白丰度；以及高内涵成像(HCI)技术，能够在单细胞水平同时监测靶蛋白降解和细胞活力等多参数指标。这些技术均适用于384孔板规格，满足高通量筛选的自动化需求。

细胞降解机制的多樣性研究

直接作用的分子胶水降解剂能够同时与靶蛋白和E3连接酶结合，直接促进两者之间的表面相互作用。典型的例子包括沙利度胺等免疫调节剂(IMiDs)，它们与cereblon(CRBN)结合后能够招募多种新底物。最近发现的(S)-ACE-OH是acepromazine的代谢产物，它能够招募TRIM21连接酶到NUP98，从而降解核孔蛋白。值得注意的是，通过不同的筛选策略（细胞表型筛选与DNA编码库筛选）发现了结构各异但功能相似的TRIM21配体，如HGC652、PRLX 93936和BMS-214662，这表明TRIM21能够容纳多样化的化学结构来诱导蛋白降解。

适配体分子胶水降解剂通过中间适配蛋白间接介导靶蛋白与E3连接酶的相互作用。(R)-CR8是这类机制的典型代表，它直接结合CDK12，进而诱导与泛素连接酶组分DDB1的结合，最终导致细胞周期蛋白CCNK的降解。有趣的是，后续研究发现更小分子的化合物如919278和dCemm3也能够有效诱导CDK12-DDB1三元复合物的形成，这表明即使是类先导化合物也能够产生分子胶水效应。目前基于这一机制的CT7439已经进入临床一期评估阶段。

变构作用降解剂通过诱导其直接结合伴侣发生构象变化，从而促进与其他蛋白的相互作用。VVD-130037是一个代表性例子，它共价结合KEAP1后不是抑制而是激活其功能，通过变构调节增强KEAP1与CUL3连接酶支架的相互作用，从而促进NRF2的泛素化和降解。类似的，selinexor通过共价结合XPO1并诱导其构象变化，使其能够被ASB8识别而降解。

化合物诱导的靶蛋白多聚化是另一种重要机制。BCL6降解剂BI-3802能够促进BCL6多聚化，这一过程增强了BCL6与其生理性E3连接酶SIAH1的相互作用，导致有效的多聚泛素化和蛋白酶体降解。从BI-3802优化得到的CCT369260在淋巴瘤异种移植小鼠模型中显示出体内BCL6降解活性。

蛋白-蛋白相互作用破坏也能够导致靶蛋白降解。MEIOB-SPATA22相互作用抑制剂isocotoin能够破坏这两个蛋白的复合物形成，导致两者的降解，这与遗传学证据一致，表明未复合的蛋白更容易被降解。类似的，HSP90与其客户蛋白的相互作用对维持客户蛋白稳定性至关重要，破坏这种相互作用会导致客户蛋白降解。

信号通路干扰提供了一种间接的降解机制。SI-3化合物通过抑制CSK激酶活性，可能通过激活LYN并诱导其自身磷酸化，产生磷酸化降解信号，最终被CBL泛素连接酶识别而降解。虽然SI-3本身结构复杂，不太可能存在于HTS库中，但这个例子说明了通过小分子干扰激酶信号通路来诱导降解的概念。

亚细胞定位改变影响蛋白周转率的机制在BLK激酶的降解中得到体现。TAK285能够将BLK从质膜重新定位到细胞质，在细胞质中泛素-蛋白酶体介导的BLK周转率更高。令人惊讶的是，TAK285诱导的降解似乎不依赖于其与BLK的直接结合，这表明化合物可能通过间接机制影响靶蛋白的周转。

特异性蛋白去稳定化机制利用细胞蛋白质量控制体系。共价配体158G12能够 destabilize PIN1蛋白，这种去稳定化与细胞系统中PIN1的降解相关，且依赖于蛋白酶体途径。类似的，SM875结合PrP蛋白的折叠中间体，阻止其完全折叠，使其被识别为错误折叠多肽而被溶酶体降解。

高通量筛选策略的实施要点

研究强调，基于细胞的降解剂筛选成功的关键在于建立稳健的、可规模化的检测方法。筛选策略可分为内源性系统和工程化系统两大类。内源性系统直接检测天然表达的靶蛋白水平，更能反映生理条件下的降解效果，但受限于检测抗体的可用性。工程化系统通过引入标签蛋白来增强检测灵敏度，但可能改变靶蛋白的正常调控和定位。

研究团队提出了一个通用的降解剂筛选工作流程（图2）：首先开发HTS兼容的检测方法，进行单浓度初筛；通过反筛排除技术干扰和细胞毒性造成的假阳性；进行浓度-反应实验评估效力；通过正交验证确认降解活性；最后进行机制解析和选择性研究。整个流程中，细胞活力反筛是排除假阳性的关键步骤。

化合物库策略对筛选成功至关重要。研究指出，当前大多数分子胶水发现都基于IMiD（免疫调节剂）骨架，这导致了三个主要问题：IMiD骨架本身在体内不稳定，衍生物存在药代动力学限制；知识产权空间拥挤；过度依赖cereblon作为E3连接酶。无偏倚活细胞筛选能够克服这些限制，利用多样性、类先导化合物库（分子量<450）发现能够招募任何细胞内E3连接酶的新颖胶水 motif。

机制解析的技术路径

降解剂hit化合物的机制解析是细胞筛选后的关键步骤。研究团队系统比较了多种机制解析方法：

通过使用特异的通路抑制剂可以快速确定降解机制的大致类别。蛋白酶体抑制剂（如bortezomib、MG132）、泛素激活酶抑制剂（MLN7243）、NAE1抑制剂（MLN4924）等可以帮助确定降解是否依赖于泛素-蛋白酶体系统。溶酶体途径抑制剂（bafilomycin A1、chloroquine）可用于检测溶酶体依赖的降解。蛋白质合成抑制剂（cycloheximide）实验有助于区分特异性降解和全局蛋白合成抑制。

CRISPR筛选作为一种遗传学方法，能够系统性敲除单个基因，从而识别参与小分子诱导降解的蛋白和通路。针对泛素-蛋白酶体系统组分的聚焦筛选或全基因组筛选都能够发现特定的E3连接酶或其他效应分子。这种方法在发现DCAF16作为GNE11诱导BRD4降解的E3连接酶中得到了成功应用。

CETSA^®（细胞热转移实验）直接评估化合物与靶标的结合情况。基于配体结合后蛋白热稳定性变化的原理，CETSA-MS（质谱联用）能够在全蛋白质组范围内识别化合物结合靶点。类似地，有限蛋白酶解质谱(LiP-MS)通过检测小分子结合引起的蛋白构象变化来识别靶标，这种方法甚至能够提供潜在的结合位点信息。

亲和纯化是最直接的靶标识别方法，通过将小分子固定在固相支持物上，从细胞或细胞裂解液中纯化结合伴侣。这种方法在发现沙利度胺靶点cereblon的过程中发挥了关键作用，但需要对原始hit化合物进行衍生化，这可能需要大量的化学优化。

研究结论与展望

这项研究系统阐述了无偏倚细胞筛选在单价降解剂发现中的重要作用，强调了多种细胞机制在靶蛋白降解中的应用价值。研究表明，基于细胞的筛选方法不仅能够发现传统的分子胶水降解剂，还能够揭示通过变构调节、蛋白多聚化、亚细胞定位改变等新颖机制发挥作用的降解剂。

研究人员指出，随着蛋白质组学技术的进步，未来可能实现对可检测蛋白质组进行蛋白丰度调节化合物的筛选。通过评估化合物混合物对治疗相关蛋白表达谱的影响，可以大幅扩展化合物、靶标和效应蛋白的组合数量。此外，无偏倚细胞筛选的应用范围有望从降解剂扩展到蛋白稳定剂等其他效应模式。

这项研究为靶向蛋白降解领域提供了重要的方法论指导，强调了细胞筛选在发现新颖降解机制方面的独特优势。随着筛选技术和机制解析方法的不断完善，无偏倚筛选策略有望为"不可成药"靶点的药物开发提供更多创新解决方案，最终为患者带来新的治疗选择。