nELISA：基于DNA介导的微珠夹心免疫分析技术实现炎症分泌组的高通量高精度定量分析

为解决现有高plex蛋白检测工具在定量准确性、精密度和成本效益方面的不足，研究人员开发了nELISA平台。该技术通过DNA介导的微珠夹心免疫分析法结合多色微珠条形码技术，成功构建191-plex炎症因子检测面板，在7,392个PBMC样本中生成140万组蛋白测量数据，灵敏度达亚皮克/毫升级，为大规模表型筛选提供了高效解决方案。

在当今生命科学研究中，蛋白质作为生物功能的直接执行者，其定量分析对理解疾病机制和药物开发具有不可替代的价值。然而，与传统基因组学和转录组学技术的飞速发展相比，蛋白质组学技术长期面临着一个关键瓶颈：如何在保持高灵敏度、高特异性的前提下，实现大规模样本的高通量、多靶点并行检测？现有主流技术如质谱分析存在对高丰度蛋白的偏好性，而传统酶联免疫吸附实验（ELISA）在多重化检测时面临试剂驱动交叉反应（rCR）的严重制约，导致多数商业化试剂盒仅限于10-plex以下检测水平。

针对这一技术难题，由Milad Dagher和David Juncker领衔的研究团队在《Nature Methods》发表了突破性研究成果。他们开发了一种名为nELISA的新一代蛋白分析平台，通过创新性地将DNA介导的微珠夹心免疫分析与先进的多色微珠条形码技术相结合，成功实现了191种炎症因子的同步定量检测，为大规模蛋白质组学研究提供了全新的技术路径。

研究团队采用的核心技术方法主要包括：1）CLAMP（共定位连接微粒子检测）技术，通过将抗体对预组装在条形码微珠上实现空间隔离；2）emFRET（增强型荧光共振能量转移）微珠编码系统，使用四种荧光染料生成384种独特光谱签名；3）基于toehold介导的链置换检测机制，通过荧光标记的DNA寡核苷酸同时解离和标记检测抗体。研究样本包括7,392个外周血单核细胞（PBMC）样本（来自6名健康供体）以及A549细胞系等模型。

CLAMP技术消除rCR的创新设计

研究团队设计的CLAMP技术在三个关键方面区别于传统夹心ELISA：预组装抗体对、可释放检测抗体和条件性信号生成。每个条形码微珠表面都预装了针对单一靶标的完整夹心免疫分析体系，检测抗体通过灵活的单链DNA栓系在微珠表面。当样本中存在目标抗原时，抗原分子与捕获抗体和检测抗体同时结合形成三元复合物。随后，通过toehold介导的链置换反应，荧光标记的置换寡核苷酸同时解离并标记检测抗体，而完整的夹心复合物仍锚定在微珠表面。这种设计确保了只有在目标抗原存在时才会产生荧光信号，非特异性结合则会被洗脱，从而将背景噪声降至最低。

nELISA平台的高通量多重化能力

为充分发挥CLAMP技术的多重检测潜力，研究团队将其与先前开发的emFRET微珠编码系统相结合。通过调控AlexaFluor 488（N1）、Cy3（N2）、Cy5（N3）和Cy5.5（N4）四种标准荧光染料的比例，成功生成384种独特的光谱条形码。优化后的工作流程使得单个流式细胞仪每天可分析1,536个孔板，充分展示了其在高通量多重免疫分析中的应用前景。

191-plex炎症面板的性能验证

研究团队构建的191-plex炎症因子检测面板涵盖了细胞因子、趋化因子和生长因子等关键炎症介质。通过单重与191重检测模式的直接比较，发现校准曲线几乎完全一致（R²=0.988），证明nELISA测量结果不受多重化影响。在"单靶标添加"实验中，36,000多种可能的非特异性相互作用中仅发现5种交叉反应，且其中3种可由共享表位等生物学原因解释。该方法检测灵敏度达0.1 pg/mL，动态范围跨越七个数量级，技术变异系数低至3%-5%，显著优于传统生物学变异水平。

与现有技术的性能比较

研究团队将nELISA与广泛应用的xMAP平台和Olink邻近延伸分析法（PEA）进行了系统比较。在与xMAP共享的36个靶标中，nELISA显示出中位数Spearman相关系数为0.92的高度一致性。值得注意的是，在"部分剔除"测试中，不一致的靶标往往与xMAP平台的高水平rCR相关，证明了nELISA在多重定量中的卓越特异性。与Olink PEA的对比进一步证实了nELISA的稳健性能，在PBMC刺激实验中两者中位数相关性超过0.95。

PBMC功能扰动筛选的应用展示

为验证nELISA的实际应用价值，研究团队将其应用于PBMC的细胞因子反应分析。通过对6名供体的PBMC施加四种不同炎症刺激剂（LPS、ConA、poly(I:C)和PMA/i）以及80种重组免疫调节蛋白的扰动，成功生成了7,392个细胞因子谱系。统一流形近似和投影（UMAP）分析显示，数据按刺激类型、供体身份和刺激浓度呈现清晰表型聚类。特别值得注意的是，具有强免疫调节作用的细胞因子扰动剂（如IL-4、IL-10、IL-1RA、IFNα2和IFNβ）产生了独特的表型聚类，证明了nELISA在免疫反应高通量表型筛选中的应用潜力。

研究还发现，不同刺激剂优先激活PBMC中不同的免疫细胞亚群。如预期那样，髓系来源的细胞因子IL-1α和IL-1β在髓系特异性刺激下上调，而T细胞来源的细胞因子IL-17A和IL-2在T细胞刺激后增加。由多种细胞类型产生的细胞因子（如TNF和IFNγ）在所有刺激条件下均升高。

nELISA与转录组学的互补性

通过与CytoSig数据库（一个已建立的细胞因子活性转录组特征数据库）的比较，研究发现nELISA检测到的449种细胞因子相互作用中，仅有45种与CytoSig PBMC数据共享。其中87%显示一致的方向性：29种在两个数据集中均上调，10种均被抑制。有趣的是，CytoSig数据集缺少TH1和TH2细胞因子调节剂的几个典型效应，而nELISA数据清晰捕捉到了这些效应。这种差异很大程度上归因于nELISA数据中包含了炎症刺激，使得在低基线表达的细胞因子中能够检测到抑制性反应。

与细胞成像技术的整合应用

研究团队还将nELISA与Cell Painting（一种利用荧光染料靶向多种细胞组件的高内涵成像检测）相结合，对Broad研究所药物再利用库中的306种特征明确的化合物进行了分析。结果显示，nELISA和Cell Painting在识别共享已知作用机制（MOA）或基因靶点的化合物方面表现出相似的效力，MOA检索率达到21%-27%，基因靶点检索率为15%-16%。两种方法的结合使总体MOA检索率提高了约33%，凸显了它们的互补性。

研究结论与意义

nELISA平台的开发标志着蛋白质组学技术的一个重要突破。该技术通过创新的CLAMP设计成功解决了长期制约多重免疫分析发展的rCR问题，将检测通量提升至每周近10,000个样本的水平，同时将检测抗体用量降至传统方法的1/50以下，显著降低了检测成本。其非破坏性采样能力支持分泌动力学的时序分析，为解析初级与下游生物效应提供了更清晰的分辨率。

尤为重要的是，nELISA与多种细胞分析技术的兼容性为多模态筛选提供了可能。其基于分泌蛋白定量而非传统趋化性检测的方法，为药物发现中的靶点参与度评估提供了更可靠的分子标志物。随着抗体技术的进一步发展，nELISA有望扩展至全分泌组、细胞内蛋白、翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用的检测，为基础研究和转化医学提供强有力的技术支撑。