T细胞是适应性免疫的“特种兵”，其抗原特异性由T细胞受体（TCR）α和β链共同决定。然而，αβ链配对信息在常规bulk TCR测序中丢失，而单细胞TCR-seq虽能保留配对，却受限于成本与通量，难以开展大队列纵向研究。如何以低成本获得深度、配对且定量的TCR谱系，一直是免疫学领域的“卡脖子”难题。
为破解这一瓶颈，Pogorelyy等人在《Nature Methods》报道TIRTL-seq（throughput-intensive rapid TCR library sequencing）。该方法将数百万外周血单个核细胞（PBMCs）分装至384孔板，每孔仅2 μl体系，利用非接触式分液与疏水覆盖层实现反应微型化，同步完成细胞裂解、逆转录及多重PCR，一次性生成数百个平行TCRα/β文库，单板试剂成本仅185美元。作者重新编写GPU加速的MAD-HYPE算法，并开发基于克隆频率相关性的T-SHELL算法，解决了高扩增克隆因“无处不在”而无法配对的难题。将六板数据合并后，从6×10 PBMCs中鉴定出989 241条独特αβTCR配对，数量比同价位10x Genomics Chromium实验高两个数量级。
纵向追踪一名SARS-CoV-2感染者发现，TIRTL-seq不仅重现了bulk 5′RACE TCR-seq检出的1 511条扩增克隆，还为其1 247条（82.6%）成功匹配TCRα链，而10x Genomics仅匹配521条。更重要的是，研究捕捉到EBV特异性克隆与SARS-CoV-2克隆截然不同的动力学：前者在急性期迅速登顶并保持高频，后者则在康复期显著收缩，血清学验证同期新发EBV与SARS-CoV-2双重感染，提示TIRTL-seq可无偏解析多病原体共同塑造的免疫景观。
主要技术路线：
384孔板组合条码+多重RT-PCR构建平行TCRα/β文库；
GPU重写的MAD-HYPE与克隆频率相关T-SHELL算法实现高效配对；
纵向采集轻症COVID-19患者三时点PBMC，并行CD4/CD8分选；
10x Genomics单细胞TCR-seq与5′RACE bulk TCR-seq作为金标准对照；
体外构建NFAT-GFP Jurkat报告系统验证TCR抗原特异性。
结果亮点：
TIRTL-seq协议优化：单孔可承载2.5×10 PBMCs，α和β链检出率均>98%，成本降至0.02美元/细胞。
配对效率与深度：单块384孔板从1×10 PBMCs获得169 423条αβTCR；六板联合近百万条，覆盖>3×10细胞。
高扩增克隆配对：T-SHELL利用跨孔读段频率相关性，成功配对73/74条10x检出的大克隆（≥5细胞）。
纵向克隆追踪：鉴定980条CD8和213条CD4克隆在急性期显著扩增，446条CD8和134条CD4克隆在康复期收缩；发现EBV与SARS-CoV-2特异TCR迥异的扩增-持久模式。
定量准确性：与10x Genomics相比，克隆频率（Spearman ρ=0.71）与log2FC（R=0.90）高度一致。
功能验证：克隆四条代表性TCR至Jurkat细胞，经多肽刺激后GFP比例升高10–35倍，证实预测特异性可靠。
结论与讨论：
TIRTL-seq首次将“低成本、高通量、配对、定量”四大需求整合到同一平台，其每百万细胞成本仅为10x Genomics的十分之一，而配对克隆数目提升逾百倍，为大队列免疫组库调查、疫苗应答评估及T细胞治疗靶点挖掘提供了可扩展的解决方案。方法学上，T-SHELL算法填补了组合条码无法配对高丰度克隆的理论空白；应用层面，研究清晰展示了不同病毒（急性SARS-CoV-2与潜伏EBV）驱动TCR克隆扩张与维持的不同策略，为理解记忆克隆形成及优化疫苗设计提供了新视角。未来，通过引入UMI校正扩增偏好、扩展至全长TCR克隆及整合单细胞转录组，TIRTL-seq有望成为精准免疫监测的常规工具。
