Sibiriline：一种新型坏死性凋亡与铁死亡双重抑制剂，通过抑制RIPK1激酶活性和（磷）脂过氧化展现治疗潜力

本期推荐一项关于程序性细胞死亡调控的创新研究。为解决坏死性凋亡(necroptosis)和铁死亡(ferroptosis)在多种严重急慢性疾病中协同激活且缺乏有效治疗手段的问题，研究人员聚焦于新型7-氮杂吲哚衍生物sibiriline(Sib)。研究发现Sib能通过双重机制发挥协同保护作用：抑制RIPK1激酶活性阻断坏死性凋亡通路，同时作为自由基捕获抗氧化剂(RTA)直接抑制磷脂过氧化(pLPO)从而阻断铁死亡。在帕金森病和囊性纤维化疾病模型中，Sib展现出显著的治疗潜力，为开发"RIPROStains"类多靶点药物提供了新策略。

在细胞死亡研究领域，科学家们近年来发现了多种非凋亡性程序性细胞死亡方式，其中坏死性凋亡(necroptosis)和铁死亡(ferroptosis)因其在炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症中的重要参与而备受关注。这两种细胞死亡方式虽然调控机制不同，但都在多种人类疾病中表现出协同激活的特点，这为治疗策略的开发带来了新的挑战和机遇。

传统单一靶点的药物治疗策略在面对复杂疾病网络时往往显得力不从心。特别是在急性肾损伤、缺血性中风等病理条件下，坏死性凋亡和铁死亡经常同时被激活，形成复杂的细胞死亡网络。这种交叉对话(crosstalk)现象促使研究人员思考：能否开发出同时靶向多个细胞死亡通路的单一化合物？这种多靶点定向配体(multi-target directed ligands)策略，即多药理学(polypharmacology)方法，可能为治疗复杂疾病提供突破性解决方案。

在此背景下，法国SeaBeLife Biotech公司的Claire Delehouzé领衔的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了一项重要研究，系统评估了7-氮杂吲哚衍生物sibiriline(Sib)的双重抑制活性。该化合物此前已被证实是受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)的有效抑制剂，且在自身免疫性肝炎模型中显示出良好的肝脏保护作用。

为全面评估Sib的治疗潜力，研究团队采用了一系列关键技术方法：通过激酶选择性筛选(KINOMEscan)评估化合物特异性；利用细胞活力检测(MTS/LDH)在多种细胞系(SH-SY5Y、HT22、NIH3T3等)中验证抗坏死性凋亡和抗铁死亡活性；采用RNA测序(RNAseq)进行转录组分析；使用荧光抑制自氧化(FENIX)测定法量化自由基捕获抗氧化活性；并在囊性纤维化患者原代鼻上皮细胞和帕金森病6-羟基多巴胺(6-OHDA)模型中验证治疗潜力。

Sibiriline抑制铁死亡细胞死亡

研究发现Sib能剂量依赖性地保护细胞免受四类铁死亡诱导剂(erastin、RSL3、FIN56、FINO2)的毒性作用，特别是对RSL3诱导的铁死亡表现出显著抑制效果。通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验证实，Sib能有效减少RSL3诱导的坏死性细胞死亡。值得注意的是，先前报道中对坏死性凋亡无活性的Sib类似物Sib-i，意外地展现出强大的铁死亡抑制活性(EC₅₀=0.09μM)，因此被重新命名为Sib-f。

在同时诱导坏死性凋亡和铁死亡的NIH3T3细胞模型中，Sib表现出双重抑制能力。当同时使用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、z-VAD.fmk和RSL3(TZR组合)处理细胞时，Sib能剂量依赖性地抑制这种双重细胞死亡诱导模式，且效果优于已知的双重抑制剂Nec-1f。

研究人员进一步检测了铁死亡的标志性特征——（磷）脂过氧化水平升高和细胞内活性氧(ROS)积累。使用C11-BODIPY 581/591探针作为（磷）脂过氧化传感器，发现RSL3诱导了高水平的（磷）脂过氧化，而10μM Sib处理可将其降低至未处理对照细胞水平。通过H2DCFDA染料检测细胞内ROS水平，结果显示Sib几乎完全消除了RSL3诱导的有害ROS增加。

Sibiriline在铁死亡细胞死亡模型中调节铁死亡相关基因表达

为探究Sib的作用机制，研究团队通过RNAseq分析评估了细胞对化学处理的转录反应，重点关注RSL3诱导的早期铁死亡。差异表达基因(DEGs)分析显示，Sib能逆转RSL3诱导的转录变化，使基因表达恢复至接近对照水平。当与已发表的60个铁死亡相关基因列表交叉分析时，发现了五个共享基因(HMOX1、PTGS2、SLC7A11、GCLC、MT1G)，其中HMOX1表达受影响最为显著——被RSL3上调而被Sib抑制。

Sibiriline作为RTA抑制铁死亡

酚类化合物是典型的自由基捕获抗氧化剂支架，而Sib分子结构中同时含有酚基和氮杂吲哚基团。研究人员通过FENIX测定法评估了Sib及其衍生物对（磷）脂衍生过氧自由基的捕获能力。FENIX测定通过监测STY-BODIPY和膜磷脂的竞争性共自氧化，定量评估RTA活性，关键参数是表观抑制速率常数(k_inh)。

研究发现Sib和Sib-f都能有效抑制STY-BODIPY氧化，其k_inh值分别为(1.0±0.1)×10³和(2.3±0.2)×10³ M^-1s^-1。Sib-f对磷脂衍生过氧自由基的反应性约为Sib的两倍，这与Sib中电负性环氮原子的缺失一致，因为已知氮原子会减缓酚类和胺类RTA中的氢原子转移(HAT)。

结构-活性关系研究

通过系统修饰Sib支架，研究人员明确了酚羟基对其RTA活性的关键作用。当Sib的游离酚羟基被甲基化后(Sib-Me)，在浓度高达32μM时也未观察到对磷脂过氧化的显著抑制效果，表明Sib的酚基是其RTA活性的关键。同时发现，在Sib-f中添加对位酚羟基(AC1584)或向Sib添加胺基(AC1610F1)能进一步增强RTA活性，其中AC1610F1成为FENIX测定中最具反应性的衍生物(k_inh=(4.8±0.1)×10³ M^-1s^-1)。

Sibiriline在囊性纤维化患者细胞铁死亡诱导中的作用

研究团队进一步在疾病相关模型中验证化合物的疗效。近期研究表明，囊性纤维化(CF)患者细胞对铁死亡诱导表现出强烈敏感性。利用来自健康对照和携带CFTR ΔF508突变患者的原代人鼻上皮细胞(HNECs)，研究人员发现异丙苯氢过氧化物(CuOOH)驱动的细胞裂解在CF鼻上皮细胞中加剧，而Sib-f(6)和AC1610F1(11)能有效抑制CuOOH诱导的细胞死亡，在健康和CF患者的鼻上皮细胞中均表现出稳健的保护能力。

Sibiriline对6-OHDA诱导的神经毒性的双重作用

为说明双重抑制剂相比两种单独细胞死亡抑制剂联合使用的优越神经保护效果，研究人员建立了帕金森病细胞模型：原代大鼠多巴胺能神经元暴露于6-羟基多巴胺(6-OHDA)。该模型先前已被证明涉及坏死性凋亡和铁死亡通路，但非同时涉及。

研究发现，单独使用Fer-1在1μM时表现出显著神经保护作用，而Nec-1s仅在0.1μM时提供部分保护。当联合使用时，1μM Fer-1与浓度递增的Nec-1s组合实现了最佳保护效果，在10μM Nec-1s时多巴胺能神经元存活率比6-OHDA条件增加33.5%。相比之下，Sib(1)表现出强效且剂量依赖的神经保护作用，在1μM时达到最大保护效果，使多巴胺能神经元增加34.5%。这些结果证明，作为一种坏死性凋亡和铁死亡双重抑制剂，Sib在该帕金森病模型中提供了有效的神经保护，表明必须同时抑制坏死性凋亡和铁死亡通路才能实现最佳神经元存活。

讨论与结论

本研究系统证实了Sib作为新型坏死性凋亡和铁死亡双重抑制剂的独特价值。通过转录组分析，发现Sib能下调HMOX1、PTGS2、SLC7A11、MT1G和GCLC等铁死亡相关基因的表达，其中HMOX1作为氧化应激反应标志物，其表达被Sib显著抑制，凸显了该化合物的细胞保护效应。

更为重要的是，通过FENIX测定法，研究明确揭示了Sib的自由基捕获抗氧化活性，其作用机制主要源于酚基与（磷）脂衍生过氧自由基的反应。值得注意的是，FENIX测定衍生的定量数据（表观抑制速率常数k_inh）能准确预测化合物的抗铁死亡效力，其中最活跃的RTA——化合物AC1610F1(11)——在测试的所有细胞系中对RSL3诱导的铁死亡都表现出最强的细胞保护作用，EC₅₀值达到亚微摩尔水平。

综合研究结果，Sib代表了一类新的同时作用于坏死性凋亡和铁死亡程序性细胞死亡通路化学制剂，可用于基于多药理学的治疗策略。研究人员将这类双重RIPK1-RTA抑制剂命名为"RIPROStains"，即同时作为（磷）脂ROS捕获剂的双重受体相互作用蛋白激酶抑制剂。已知的RIPK1抑制剂Nec-1此前已被证明具有RTA活性，按定义也属于RIPROStains类化合物。

该研究不仅揭示了Sib的双重抑制机制，还通过结构-活性关系研究证明可以设计高活性RTA化合物，为目前医疗需求未满足的复杂疾病（如慢性神经退行性疾病）的治疗管理开辟了新途径。这种针对多细胞死亡通路的协同抑制策略，特别是针对坏死性凋亡和铁死亡的并发抑制，为开发下一代治疗复杂人类疾病的创新疗法提供了重要理论基础和实验依据。