靶向间皮素的新型uCAR样NK细胞疗法：非基因工程模块化平台实现实体瘤深度渗透与高效杀伤

为解决自然杀伤（NK）细胞在实体瘤治疗中靶向性不足和肿瘤浸润能力有限的问题，研究人员开发了一种新型抗间皮素（MSLN）uCAR样NK细胞疗法。该研究利用SpyTag/SpyCatcher系统构建了双特异性细胞衔接器（MSLNxCD16A），并将其与细胞因子诱导的记忆样（CIML）NK细胞预复合，同时整合了肿瘤穿透肽uCendR。研究结果表明，该疗法在体外和体内均表现出对MSLN阳性肿瘤细胞的特异性强效杀伤，且uCendR的整合显著增强了NK细胞在肿瘤组织中的渗透能力，为MSLN阳性实体瘤的免疫治疗提供了新的策略。

在癌症免疫治疗领域，自然杀伤（NK）细胞因其强大的天然细胞毒性、不依赖主要组织相容性复合体（MHC）限制以及较低的移植物抗宿主病（GvHD）和细胞因子释放综合征（CRS）风险，被视为极具潜力的“现货型”细胞疗法。然而，当面对实体瘤时，NK细胞疗法常常面临两大瓶颈：一是缺乏对肿瘤细胞的特异性识别能力，导致“误伤”正常细胞或“脱靶”效应；二是实体瘤致密的细胞外基质和高间质压力构成了物理屏障，限制了NK细胞向肿瘤内部的浸润，使其难以到达并清除深部的肿瘤细胞。

为了攻克这些难题，南京大学医学院附属鼓楼医院刘宝瑞教授、李茹恬教授和刘芹教授团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志上发表了一项突破性研究。他们开发了一种名为“抗间皮素（MSLN）uCAR样NK细胞”的新型疗法，该疗法不仅赋予了NK细胞精准的“导航”能力，还为其配备了“破壁”利器，使其能够深入肿瘤内部，实现对实体瘤的高效清除。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用SpyTag/SpyCatcher蛋白偶联系统构建了靶向MSLN和NK细胞表面CD16A的双特异性细胞衔接器（MSLNxCD16A）；通过IL-12、IL-15和IL-18诱导人脐带血来源的NK细胞分化为细胞因子诱导的记忆样（CIML）NK细胞；将MSLNxCD16A与CIML NK细胞预复合，构建了抗MSLN CAR样NK细胞；进一步在MSLN靶向端整合了肿瘤穿透肽uCendR，构建了抗MSLN uCAR样NK细胞；通过体外细胞毒性、脱颗粒、细胞因子分泌等实验评估细胞功能；利用皮下移植瘤、肺转移、腹膜播散及原位胰腺癌等多种小鼠模型验证了该疗法的体内抗肿瘤活性和安全性。

研究结果

1. 双特异性细胞衔接器MSLNxCD16A的成功构建与表征

研究人员首先利用SpyTag/SpyCatcher系统，将靶向MSLN的SpyCatcher蛋白与靶向NK细胞表面CD16A的SpyTag蛋白进行共价偶联，成功构建了双特异性细胞衔接器MSLNxCD16A。该蛋白纯度超过90%，且能稳定地同时结合MSLN阳性肿瘤细胞和CIML NK细胞，为后续构建CAR样NK细胞奠定了基础。

2. MSLNxCD16A特异性增强CIML NK细胞的效应功能

体外实验表明，MSLNxCD16A能够特异性激活CIML NK细胞。当与MSLN阳性肿瘤细胞共培养时，MSLNxCD16A处理的NK细胞表现出更高的脱颗粒水平（CD107a表达）、更强的活化状态（CD69表达）以及更高的干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌。更重要的是，MSLNxCD16A介导了CIML NK细胞对MSLN阳性肿瘤细胞的特异性杀伤，而对MSLN阴性细胞则无此效应。

3. 抗MSLN CAR样NK细胞展现优异的活性和稳定性

将MSLNxCD16A与CIML NK细胞预复合并洗涤后，成功构建了抗MSLN CAR样NK细胞。该细胞表面能稳定锚定MSLNxCD16A至少48小时，并在此时间内维持对MSLN阳性肿瘤细胞的特异性杀伤能力。在多种MSLN阳性肿瘤细胞系中，抗MSLN CAR样NK细胞均表现出显著优于未修饰CIML NK细胞的杀伤活性。

4. 抗MSLN CAR样NK细胞在体内有效抑制肿瘤生长和转移

在MSLN阳性胃癌皮下移植瘤模型中，抗MSLN CAR样NK细胞治疗组肿瘤生长受到显著抑制，其疗效优于单独输注MSLNxCD16A和CIML NK细胞的联合治疗组。在肺转移和腹膜播散模型中，抗MSLN CAR样NK细胞同样表现出强大的抑制肿瘤转移和播散的能力，且对MSLN低表达肿瘤无效，显示出良好的靶向特异性。安全性评估显示，该疗法未引起明显的体重下降或主要器官毒性。

5. 整合肿瘤穿透肽的uCAR样NK细胞展现卓越的肿瘤渗透能力

为了克服实体瘤的渗透屏障，研究人员在MSLN靶向端整合了肿瘤穿透肽uCendR，构建了抗MSLN uCAR样NK细胞。体外多细胞球体（MCS）模型显示，uCAR样NK细胞能够深入肿瘤球体内部，其渗透能力是普通CAR样NK细胞的3.2倍。在体内，uCAR样NK细胞在肿瘤部位的富集程度显著高于其他组。更重要的是，在模拟肿瘤微环境更复杂的原位胰腺癌模型中，抗MSLN uCAR样NK细胞展现出比普通CAR样NK细胞更优越的抗肿瘤疗效，证实了增强肿瘤渗透对于提升实体瘤治疗效果的重要性。

研究结论与讨论

本研究成功开发了一种非基因工程、模块化的抗MSLN uCAR样NK细胞疗法。该疗法通过SpyTag/SpyCatcher系统将双特异性衔接器稳定锚定在CIML NK细胞表面，赋予其精准的靶向能力；同时，整合的肿瘤穿透肽uCendR有效解决了NK细胞在实体瘤中浸润不足的难题。研究结果表明，该疗法在体外和体内均能高效、特异地杀伤MSLN阳性肿瘤细胞，并具有良好的安全性。

这项研究的创新之处在于，它构建了一个“即插即用”的通用平台。通过更换靶向MSLN的模块，该平台可以快速适配其他肿瘤相关抗原，为更多患者提供治疗可能。此外，该疗法避免了复杂的基因编辑过程，简化了生产流程，降低了成本，为细胞免疫治疗的临床转化提供了新思路。该研究不仅为MSLN阳性实体瘤患者带来了新的希望，也为开发下一代“现货型”细胞疗法奠定了坚实的基础。