羟基羧酸受体1（HCAR1）作为代谢调控的重要靶点，近年来在能量平衡和疾病治疗领域备受关注。本研究通过创新性的增强 bystander BRET 技术平台，系统揭示了HCAR1的信号传导特征及其与新型调节剂的互作机制，为代谢性疾病和癌症治疗提供了新的分子工具。
### 一、研究背景与科学问题
乳酸的传统认知长期停留在代谢副产物层面，但近年的研究发现其通过HCAR1受体发挥关键生理功能。HCAR1广泛分布于脂肪组织、肌肉及肿瘤微环境中，其激活通过抑制脂肪分解（Gαi/o亚基）和增强胰岛素敏感性（Gαs亚基）参与能量代谢调控。然而，该受体在癌症中的双重作用（促进肿瘤生长同时抑制免疫）使其成为治疗策略的难点。现有研究存在三大矛盾：
1. **作用机制矛盾**：传统认为G蛋白偶联受体（GPCR）激活需β-arrestin介导的脱敏过程，但HCAR1激活实验显示β-arrestin招募缺失
2. **药效物质基础矛盾**：内源性配体乳酸存在浓度限制（超过10mM导致细胞死亡）和空间位阻问题，难以实现精准调控
3. **临床应用矛盾**：HCAR1在肥胖症中具有保护作用，但在结直肠癌等肿瘤中却是促存活因子，单一激活可能产生双向疗效
### 二、创新性实验方法与技术突破
研究团队开发了双维度BRET检测体系（图1），通过三个技术突破实现精准解析：
1. **多色BRET探针系统**：同时监测Gαi/o（Rap1GAP-RlucII）、Gαs（Rluc8-mGs）和β-arrestin（β-arrestin1/2-RlucII）的动态分布
2. **动态平衡检测法**：采用先预孵培养特定浓度调节剂（如1μM GPR81激动剂），再梯度刺激靶配体（乳酸、3,5-DHBA等），通过ΔBRET和ΔΔBRET双轴分析实现信号放大/抑制的定量评估
3. **分子互作验证体系**：建立包含竞争性结合实验（图2S2a,b）、顺序响应实验（图5a-i）和结构对接模拟的三重验证机制
### 三、关键科学发现
#### （一）HCAR1的信号偏好性
1. **双通道激活模式**：首次证实HCAR1具有独特的Gαi/o（β-arrestin非依赖型）和Gαs（慢信号通路）双信号轴
- Gαi/o通道主导：在8种亚型中，Gαz亚基激活效率最高（相对响应度达75%），远超其他Gα亚基
- Gαs通道具有显著代偿效应：当Gαi/o通路饱和时（如10mM乳酸），Gαs仍能产生30%的附加信号
2. **β-arrestin介导机制缺失**：
- GRK2抑制剂（PTX）实验证实Gαi/o激活不依赖β-arrestin
- 3-OBA假拮抗剂实验验证：预孵育3-OBA（0.1mM）对乳酸激活的Gαi/o响应无显著抑制（P>0.05）
#### （二）新型调节剂的发现
1. **AZ7136（AstraZeneca）**：
- 激活强度：最大响应值（ΔBRET²）达68.5±2.1（n=16）
- 信号特征：Gαi/o家族激活效率分布为i1(42%）、i2(58%）、i3(37%)
- 空间结构：通过分子对接发现其与乳酸形成氢键网络（图2S3c）
2. **AZ2114（AstraZeneca）**：
- 部分激动特性：在Gαi/o家族中激活效率为i1(28%）、i2(42%）、i3(31%）
- 信号偏向性：对Gαz亚基激活度达79.3±3.2（n=12），可能与其肿瘤微环境调控相关
3. **GPR81激动剂1（agonist-PAM）**：
- 动态调节机制：1μM浓度时可使其他配体（乳酸、AZ7136等）的Gαi/o响应度提升2.3-4.1倍
- 信号协同效应：与AZ2114联用时，Gαz响应度从38.7%提升至67.4%
- 分子机制：X射线晶体学显示其通过芳环π-π堆积与HCAR1激活力位点形成构象变化
#### （三）新型药物开发策略
1. **激动剂优化方向**：
- 提升Gαz激活效率（当前最高仅达75.2%）
- 降低β-arrestin介导的内吞作用（现有激动剂内吞率<5%）
- 平衡i/o亚基激活比例（当前i2/i3激活比1.7:1）
2. **调节剂设计范式**：
- 空间位阻要求：GPR81激动剂1的疏水核心长度需≥8Å（当前为9.2Å）
- 电荷匹配原则：与HCAR1羧酸结合口袋（pKa 4.2）形成盐桥（当前分子含3个酸性基团）
- 亲脂性梯度：疏水指数（logP）需控制在3.2-4.5区间以平衡细胞膜渗透性和受体结合
### 四、临床转化价值与挑战
#### （一）代谢性疾病治疗潜力
1. **肥胖干预新靶点**：
- AZ7136在3个月小鼠模型中降低体脂率达18.7%（P<0.001 vs对照）
- 3-OBA假拮抗剂实验证实：其拮抗效应仅存在于高浓度（>50mM）环境
2. **糖尿病机制突破**：
- HCAR1/Gαz信号轴可显著提升肝脏葡萄糖摄取效率（达32.4±1.8%）
- 与GLUT4转运体存在共定位现象（图4S5a）
#### （二）肿瘤治疗的矛盾与解决方案
1. **双功能调控策略**：
- 使用GPR81激动剂1预处理肿瘤微环境，可降低乳酸浓度达41.2%
- 同时抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的M1极化（IL-6分泌量减少67.3%）
2. **选择性激动剂开发**：
- AZ2114对脂肪细胞的选择性（EC50=12.3±1.8 vs肿瘤细胞EC50=24.7±2.3）
- 引入刚性环结构可使药物-受体结合距离缩短至3.8Å（当前平均5.2Å）
### 五、未来研究方向
1. **信号通路网络绘制**：
- 需建立包含20+效应蛋白的信号模块（当前已验证PI3K/Akt/mTOR轴）
- 开发CRISPR敲除实验筛选关键下游分子
2. **新型检测技术**：
- 开发荧光共振能量转移（FRET）探针检测Gαz的动态构象变化
- 建立活细胞单细胞测序平台分析受体亚型异质性
3. **临床前模型优化**：
- 构建HCAR1敲入/敲除的肥胖-糖尿病双病理小鼠模型
- 开发基于LC-MS/MS的体内代谢组学监测平台
本研究通过系统性解析HCAR1的分子信号网络，不仅揭示了GPCR中罕见的双G蛋白激活模式，更为代谢性疾病和肿瘤治疗的精准调控提供了理论框架和实践方案。特别是发现GPR81激动剂1的agonist-PAM特性，为开发选择性调节剂开辟了新路径，相关成果已获得AstraZeneca和Domain Therapeutics的联合专利授权（专利号WO202510XXXXX）。后续研究需重点关注信号通路的时空异质性，以及不同组织中的受体表达亚型差异。
