近年来，癌症基因组学领域对拷贝数变异（CNVs）的检测技术提出了更高要求。CNVs作为驱动肿瘤发生的重要遗传学事件，其检测不仅有助于精准分型（如MDM2扩增在脂肪瘤中的诊断价值），还能指导靶向治疗选择（如HER2扩增与曲妥珠单抗的关联）。当前临床常用的SNP微阵列技术存在显著局限性：首先，FFPE样本的DNA降解和固定剂干扰会导致探针杂交效率下降，其次，传统方法依赖高纯度肿瘤细胞（>50%），而临床样本中往往存在异质性。因此，本研究聚焦于评估基于超低通全基因组测序（ULP-WGS）的CNV检测工具在FFPE样本中的性能，旨在为临床转化提供可靠依据。
### 一、技术背景与挑战
ULP-WGS通过深度测序（通常覆盖0.1×-1×）结合算法重建基因组，其优势在于能检测>10kb的CNVs，这是传统靶向测序难以企及的。然而，FFPE样本特有的GC含量偏移（导致测序深度不均）、固定剂导致的DNA损伤（产生特征性碱基组成偏移）以及样本异质性（如肿瘤细胞比例差异）构成三重挑战。当前主流的ULP-WGS CNV检测工具包括CNVpytor、ichorCNA和WislationorX，但其在FFPE场景下的适用性尚未明确。
### 二、实验设计与核心发现
研究团队构建了包含32例非肿瘤样本和41例肿瘤样本的验证体系，其中：
1. **参考标准**：采用临床验证的FISH、免疫组化及SNP阵列结果作为金标准，确保CNV分类（高/低水平扩增、纯合/杂合缺失）的准确性。
2. **关键参数优化**：
- **测序深度**：人工降深实验显示，WVintageorX在0.1×覆盖下仍能保持TP检出率，而CNVpytor需≥0.25×覆盖。
- **分箱策略**：250kb分箱时，WVintageorX达到最佳平衡（TP=12/13，FP=0），较1Mb分箱减少30%的HLAMP漏检。
- **置信阈值**：|Z-score|>10可过滤98%的FP，同时保留所有Hom DEL（表1）。
3. **临床样本验证**：
- **训练集**（10肿瘤+10非肿瘤）：WVintageorX以11/26 TP（42%）和0 FP的检测表现最优，显著优于SNP阵列（12/26 TP，36 FP）。
- **验证集**（19肿瘤样本）：WVintageorX检出34/37 CNVs（92%），其中13/13 Hom DEL全部检出，HLAMP检出率75%（3/4），LLAMP达88%（15/17）。
- **关键阈值**：Z-score>10（平均72.6）、分箱250kb，覆盖0.1×时TP保持稳定。
### 三、核心发现解析
1. **技术路线对比**：
- **SNP阵列**：依赖探针特异性杂交，在FFPE样本中产生大量假扩增（31/36 FP为AMP），尤其对<500kb的小CNV敏感度不足。
- **传统CNVpytor**：通过深度差异计算，但受限于低覆盖度（0.3×-0.8×）下BAF分析失效，导致FP高达27个。
- **ichorCNA**：通过cfDNA肿瘤纯度校正（需PON库），在HLAMP检测上表现最佳（4/4 TP），但FP达32个（17为DEL）。
- **WVintageorX**：创新性融合 reads pair 和 assembly 算法，在低覆盖度下仍能维持高特异性（FP=1），TP检出率达42%-92%。
2. **FFPE样本关键参数影响**：
- **样本年龄**：5年陈旧样本（平均MAD=0.08）与新鲜样本性能无显著差异，但需DNA浓度>50ng。
- **肿瘤纯度**：当细胞含量>50%时，CNV检出率提升3倍（均值28 vs 9.8），而<25%时仅能检测1.8±0.6个CNV。
- **分箱策略**：1Mb分箱导致6/13 LLAMP漏检，250kb分箱使 amp 假阳性下降90%（从31到1）。
3. **技术经济性分析**：
- **成本效益**：ULP-WGS单样本成本较tNGS降低40%，且可并行处理30+样本（通过覆盖度压缩技术）。
- **周转时间**：WVintageorX的TAT为3.5天（测序2天+分析1.5天），较传统NGS流程缩短60%。
### 四、临床转化路径
1. **标准化工作流程**：
- **样本预处理**：采用QIAcube+FFPE提取试剂盒（QIAGEN），确保DNA纯度>90%。
- **测序参数**：片段大小150bp，测序深度0.1×-1×（根据样本状态动态调整）。
- **分析参数**：WVintageorX默认设置（250kb分箱，Z-score>10）可覆盖85%临床需求。
2. **误差控制机制**：
- **PON库构建**：需包含≥20例非肿瘤样本，年龄覆盖0-5年，DNA浓度6-200ng。
- **双算法校验**：建议联合应用WVintageorX和ichorCNA，取共性结果（TP=31/34，特异性>98%）。
- **质量监控**：MAD<0.15（QC通过率92%）、Z-score>50（CN>3）作为双保险机制。
3. **特殊场景应对**：
- **低肿瘤纯度样本**（<25%）：采用肿瘤纯度校正算法（如ichorCNA的TumorPct模块），可提升30% TP检出率。
- **陈旧样本**（>5年）：需增加10%测序量（总成本增幅<5%）以补偿GC偏移。
### 五、局限性及改进方向
1. **当前瓶颈**：
- **检测下限**：HLAMP（2 copies）的LOD为0.1×覆盖，LLAMP（1.5 copies）需0.2×覆盖。
- **算法盲区**：无法检测<5kb的CNVs（仅占临床意义的8%）。
2. **优化建议**：
- **混合测序策略**：对高纯度样本（>75%）采用150bp片段测序，低纯度样本（<25%）采用200bp片段。
- **深度学习辅助**：引入卷积神经网络（CNN）分析测序深度曲线的局部异常（如使用TensorFlow实现Z-score优化）。
- **动态PON库**：建立包含不同年龄（0-5年）、病理类型（肿瘤/非肿瘤）的PON数据库，提升算法泛化性。
### 六、结论与展望
本研究证实，经优化的WVintageorX算法在FFPE样本中展现出显著优势：TP检出率91.8%（SNP阵列为46.2%），FP率降低至2.7%（SNP阵列达36.8%），同时保持成本优势（单价$50 vs $80）。临床应用建议：
1. **标准化分析包**：整合WVintageorX算法、动态PON库和MAD<0.15的QC标准。
2. **多模态验证**：对高风险样本（如HLAMP≥3 copies）需结合FISH或CohortNGS确认。
3. **硬件升级**：采用NextSeq 550x平台（单芯片可并行处理60例样本）降低人均成本。
未来研究应着重解决两个核心问题：开发适用于<20%肿瘤纯度的CNV校正模型，以及建立通用的FFPE样本预处理标准（如固定剂类型标准化）。随着10x Genomics Visium技术的普及，空间转录组学联合CNV分析可能成为新方向，这为克服组织异质性提供了创新思路。
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