在全球范围内，男性不育已成为严重影响家庭幸福和社会发展的公共卫生问题。其中，弱畸精子症（asthenoteratozoospermia）作为一种典型的精子功能障碍，表现为精子活力严重下降（前向运动精子比例<32%）和形态异常率增高（正常形态精子<4%）。尽管辅助生殖技术不断发展，但由于精子功能缺陷导致的受精失败仍然困扰着众多不孕夫妇。遗传因素被认为是导致精子发生异常的重要原因，然而目前对相关基因突变如何影响精子形成的分子机制尚不明确，特别是RNA修饰（如m6A）及其结合蛋白在精子发生过程中的调控作用仍有待深入探索。RNA结合蛋白（RBP）在精子发生的转录后调控中发挥核心作用，其中异质核核糖核蛋白（hnRNP）家族成员通过调控RNA剪接、稳定性和翻译等过程参与生殖细胞发育。N6-甲基腺苷（m6A）作为哺乳动物mRNA中最常见的内部修饰，通过"写入器"（如METTL3、METTL14）、"擦除器"（如FTO、ALKBH5）和"阅读器"（如YTH结构域蛋白、hnRNPs）的动态调控，影响RNA代谢的多个环节。已有研究表明m6A在雄性生殖细胞发育中不可或缺，但其在精子形成后期——即圆形精子细胞向成熟精子转变的关键阶段——的具体功能尚不清楚。针对这一科学问题，浙江大学医学院附属第四医院生殖医学中心与复旦大学附属妇产科医院生殖与发育研究所等团队合作，在《Signal Transduction and Targeted Therapy》发表了最新研究成果。研究人员通过对572例弱畸精子症患者进行全外显子测序，首次发现HNRNPR基因突变与男性不育密切相关，并利用基因编辑小鼠模型深入解析了hnRNPR通过m6A依赖性方式调控Skap2基因剪接的分子机制，最终开发出基于细胞外囊泡的SKAP2蛋白递送治疗策略。研究采用的主要技术方法包括：临床样本的全外显子测序和Sanger测序验证；基因编辑小鼠模型（点突变 knock-in 和条件性基因敲除）的构建与表型分析；单细胞RNA测序（scRNA-seq）和蛋白质组学分析；RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）和m6A测序（meRIP-seq）；细胞外囊泡（mEVs）的分离、SKAP2蛋白装载及体内外功能验证。Mutations in the HNRNPR gene cause asthenoteratozoospermia and its association with male infertility研究人员首先在572例弱畸精子症患者中鉴定出3例携带HNRNPR基因突变的患者（来自近亲和非近亲家庭），包括纯合错义突变（c.1540G>A）和复合杂合错义突变（c.1280A>C, c.1369G>A）。临床分析显示患者精子浓度正常，但前向运动能力和正常形态比例显著降低。透射电镜观察到患者精子顶体脱落和颈部结构紊乱，首次将HNRNPR突变与人类弱畸精子症联系起来。Hnrnpr mutations lead to asthenoteratozoospermia and male sterility in mice为了验证HNRNPR的生物学功能，研究人员构建了Hnrnpr点突变 knock-in（KI）小鼠模型。虽然KI小鼠睾丸重量和精子数量正常，但完全丧失生育能力。计算机辅助精液分析（CASA）显示KI小鼠精子总活力和前向运动能力显著下降，96.35%的精子存在头和鞭毛形态异常。透射电镜进一步揭示精子鞭毛中经典的"9+2"微管排列缺失，以及多个鞭毛被包裹在同一个细胞膜内的超微结构缺陷。Hnrnpr mutations result in abnormal spermiogenesis and sperm malformation通过阶段性分析精子发生过程，研究发现Hnrnpr突变导致精子形成多个环节异常。在精子发生第9期，突变小鼠精子顶体形态开始出现缺陷，透射电镜显示顶体定位异常、核伸长受阻。同时，微管结构manchette（一种在精子头部形成和鞭毛发生中起关键作用的临时性微管结构）出现不对称和过度伸长，表明hnRNPR对顶体附着、核浓缩和manchette发育的协调至关重要。
The alterations of transcriptome, protein regulation and RNA splicing are attributed to Hnrnpr mutations单细胞RNA测序分析发现，虽然Hnrnpr突变不影响睾丸细胞类型组成，但在圆形精子细胞中鉴定出498个差异表达基因，其中Skap2表达显著下调。蛋白质组学分析进一步确认SKAP2和F-ACTIN（丝状肌动蛋白）蛋白水平在突变精子中降低。选择性剪接分析显示Hnrnpr突变导致1718个剪接事件异常，其中外显子跳跃（SE）最为常见，且受影响基因显著富集于细胞骨架相关通路。
hnRNPR regulates Skap2 alternative splicing via an m6A-dependent manner机制研究表明，hnRNPR直接结合Skap2 pre-mRNA的编码区（CDS）和3'非翻译区（3'UTR），这些区域与m6A修饰位点高度重叠。通过迷你基因（minigene）实验证实，破坏预测的m6A位点会导致Skap2外显子2跳跃增加，说明hnRNPR通过m6A依赖性方式调控Skap2剪接。这一发现首次将m6A介导的剪接调控与精子细胞骨架建立联系起来。SKAP2 regulates sperm cytoskeletal organization to maintain spermiogenesis and male fertility研究人员进一步构建了生殖细胞特异性Skap2条件性敲除（Skap2 D-cKO）小鼠，发现其重现了Hnrnpr突变体的表型：精子活力下降、形态异常、F-ACTIN组装缺陷和manchette发育异常。Skap2缺失导致精子DNA碎片增加和完全不育，证实SKAP2是hnRNPR下游的关键效应分子，在细胞骨架组织和精子结构完整性中发挥核心作用。mEVs-SKAP2 ameliorates sperm motility and morphology by improving cytoskeletal remodeling and mitochondrial organization in vivo基于上述发现，研究团队开发了治疗性干预策略：利用牛奶来源的细胞外囊泡（mEVs）装载SKAP2蛋白（mEVs-SKAP2），通过睾丸输出小管微注射递送至生精小管。体内实验表明，mEVs-SKAP2处理能显著改善Hnrnpr突变小鼠的精子活力和形态，恢复F-ACTIN组装和线粒体鞘的空间组织，尽管对轴丝"9+2"微管结构的修复效果有限。mEVs-SKAP2 rescues sperm motility and morphology in vitro mouse and human models体外实验进一步验证了mEVs-SKAP2的治疗潜力。与正常人、HNRNPR突变患者和特发性弱畸精子症患者的精子共培养后，mEVs-SKAP2能显著增强精子运动能力（包括总活力、前向运动能力和平均路径速度），减少鞭毛弯曲频率，并促进F-ACTIN聚合。虽然对精子整体形态的改善效果不如体内注射明显，但证实了SKAP2蛋白递送在跨物种中的功能性修复能力。本研究通过整合临床遗传学、机制解析和治疗探索，首次确立hnRNPR为精子发生的关键调控因子，并揭示其通过m6A依赖性剪接调控Skap2表达，进而影响精子细胞骨架组织和线粒体功能的新机制。更重要的是，研究开发的mEVs-SKAP2治疗策略不仅为理解精子细胞骨架动力学提供了新视角，也为男性不育的靶向治疗开辟了创新途径。这种基于细胞外囊泡的蛋白质递送方法，避免了基因治疗的潜在风险，具有较高的临床转化潜力。该研究不仅深化了对m6A介导的转录后调控在生殖生物学中作用的认识，也为解决男性不育这一全球性健康问题提供了新的理论基础和治疗思路。
