骨骼作为人体的支撑架构，其健康状态直接关系到生活质量。然而，随着人口老龄化进程加速，骨质疏松症已成为困扰中老年人群、尤其是绝经后女性的重大公共卫生问题。这种以骨量减少、骨微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病，犹如一座被悄然掏空根基的建筑，显著增加骨折风险，给患者家庭和社会带来沉重负担。当前主流治疗方案包括抗骨吸收药物（如双膦酸盐）和促骨形成剂（如特立帕肽），但它们存在不良反应个体差异大等局限性，迫使科学家们不断寻找新的治疗靶点。
正是在这一背景下，脯氨酰内肽酶(Prolyl Endopeptidase, PREP)进入了研究人员的视野。这种能够特异性切割脯氨酸残基羧基端肽键的内肽酶，此前已知主要参与神经肽代谢，与帕金森病等神经系统疾病相关。有趣的是，胶原蛋白作为骨骼基质的主要成分，其降解过程也可能受到PREP的调控。那么，PREP是否在骨质疏松这一“静悄悄”的骨骼代谢性疾病中扮演着关键角色？其作用机制又如何？为了解答这些疑问，来自上海交通大学医学院附属新华医院脊柱中心的郑火亮、蔡浩、陈鹏波等研究人员开展了一项深入探索。
研究人员首先从大数据分析入手，通过对三个独立的基因表达数据集(GSE33567、GSE57265、GSE154991)进行分析，发现了一个一致的模式：在C2C12细胞、人骨髓间充质干细胞(h-BMSC)和小鼠原代成骨细胞中，成骨分化过程中PREP的表达均显著下调。这一线索通过Western blotting和RT-qPCR实验得到了进一步验证——在h-BMSC、m-BMSC和MC3T3-E1细胞的成骨分化过程中，PREP在mRNA和蛋白水平均呈现持续性下降趋势。
为了探究PREP在体内的实际功能，研究团队构建了PREP基因敲除小鼠模型。在年轻雌性C57小鼠卵巢切除(OVX)诱导的骨质疏松模型中，结果令人振奋：与野生型OVX组相比，PREP敲除小鼠的股骨远端骨矿物质密度(BMD)、骨小梁数量(Tb.N)、骨体积分数(BV/TV)和小梁厚度(Tb.Th)均得到显著改善，甚至皮质骨厚度(Ct.Th)也有所增加。组织染色显示，PREP敲除组骨形成率和矿化沉积率明显提升，Runx2（成骨关键转录因子）表达增强，而破骨细胞活性（通过TRAP染色评估）则受到抑制。
骨再生能力的评估同样令人印象深刻。在股骨皮质骨缺损模型中，PREP敲除小鼠的骨缺损几乎完全愈合，微CT显示矿化骨痂的BMD、BV/TV、Tb.Th和Tb.N值显著高于野生型，而骨吸收标志物β-CTX水平下降，骨形成标志物P1NP水平上升。这表明PREP缺失不仅防止骨量丢失，还能主动促进骨修复。
深入机制探索发现，PREP对成骨分化的调控主要依赖于Wnt/β-catenin信号通路。PREP敲除导致β-catenin上游调控因子AXIN1表达下降，激活的β-catenin水平上升；而PREP过表达则产生相反效果。当使用β-catenin通路抑制剂IWR-1处理时，PREP敲除带来的成骨促进作用被抵消；反之，使用激动剂SLK2001则能逆转PREP过表达对成骨的抑制。这一系列精巧的实验证实了PREP-Wnt/β-catenin轴在成骨分化中的核心地位。
令人惊讶的是，PREP的影响不仅限于成骨细胞。在破骨细胞方面，PREP敲除显著抑制了RAW264.7细胞和小鼠单核细胞的破骨分化能力，降低CTSK、NFATc1、TRAP和MMP9等破骨标志基因表达，并减小破骨细胞体积和骨吸收陷窝面积；而PREP过表达则产生完全相反的促破骨效果。这种对骨代谢“双向调节”的能力，使PREP成为一个极具潜力的治疗靶点。
研究并未止步于雌激素缺乏模型。在20月龄老年小鼠的衰老相关骨质疏松模型中，PREP敲除同样展现出显著保护作用：骨密度提升、骨微结构改善、骨形成增强而骨吸收减弱。这表明PREP的调控作用具有普适性，不依赖于特定病因。
关键技术方法概述
本研究综合运用了基因表达谱分析（GEO数据库）、基因敲除动物模型构建、显微CT(Micro-CT)骨微结构分析、细胞培养与诱导分化（包括成骨细胞和破骨细胞）、Western blotting蛋白免疫印迹、实时定量PCR(RT-qPCR)、组织化学染色（HE、TRAP、ALP、ARS等）、免疫组化/免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及小分子抑制剂/激动剂干预等关键技术。实验所用细胞包括小鼠骨髓间充质干细胞(m-BMSC)、人骨髓间充质干细胞(h-BMSC)、MC3T3-E1成骨细胞系、RAW264.7破骨前体细胞及小鼠骨髓来源巨噬细胞(m-BMMs)；动物模型采用雌性C57BL/6小鼠（10周龄用于OVX模型，20月龄用于衰老模型）。
2.1 PREP在成骨分化过程中下调
通过分析公共数据库和实验验证，确认PREP在多种细胞成骨分化过程中表达持续下降，提示其可能负向调控成骨分化。
2.2 PREP敲除预防卵巢切除引起的骨丢失
在OVX诱导的骨质疏松模型中，PREP基因缺失显著改善骨密度、骨微结构参数和皮质骨厚度，增强骨形成，抑制骨吸收。
2.3 PREP缺陷促进体内骨再生
在股骨皮质骨缺损模型中，PREP敲除促进骨缺损愈合，提高骨痂质量，改善血清骨代谢标志物水平（P1NP升高，β-CTX降低）。
2.4 PREP在体外抑制BMSCs的成骨分化
PREP敲除增强骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化能力，提高成骨标志基因（RUNX2、OSTERIX、OCN、ALP）表达和ALP活性；而PREP过表达则抑制成骨分化，且不影响细胞凋亡。
2.5 PREP通过β-catenin信号通路调控成骨分化
机制研究表明，PREP通过调节AXIN1表达影响β-catenin活性。药理学干预（抑制剂IWR-1和激动剂SLK2001）证实Wnt/β-catenin通路是PREP调控成骨分化的关键介质。
2.6 PREP影响破骨细胞生成过程
PREP敲除抑制破骨细胞分化、融合和骨吸收功能，降低破骨标志基因表达；PREP过表达则促进破骨生成和骨吸收活性。
2.7 PREP敲除缓解年龄相关性骨质疏松
在老年小鼠模型中，PREP缺失同样改善骨密度、微结构，促进骨形成，抑制骨吸收，证明其疗效不限于雌激素缺乏模型。
结论与展望
本研究系统阐明了PREP在骨质疏松发病中的双重角色：既通过抑制Wnt/β-catenin通路阻碍成骨分化，又通过促进破骨生成加速骨吸收。沉默PREP能产生骨合成代谢与抗分解代谢的双重获益，在雌激素缺乏和衰老两种主要骨质疏松模型中均展现出显著治疗效果。这一发现不仅拓展了PREP的生物学功能认知，更重要的是为骨质疏松治疗提供了全新的潜在靶点。尽管其临床转化仍面临靶向性、安全性及与现有疗法比较等挑战，但无疑为未来抗骨质疏松药物研发开辟了富有前景的新方向。研究成果发表于《Cell Death Discovery》，为理解骨代谢平衡调控机制贡献了重要证据。
打赏
