靶向联合治疗：攻克弥漫大 B 细胞淋巴瘤耐药难题的新希望

近期，来自美国迈阿密大学米勒医学院（University of Miami Miller School of Medicine）的 Caroline A. Coughlin、Dhanvantri Chahar 等研究人员，在《Blood Cancer Journal》期刊上发表了题为 “Bruton’s tyrosine kinase inhibition re-sensitizes multidrug-resistant DLBCL tumors driven by BCL10 gain-of-function mutants to venetoclax” 的论文。这一研究聚焦于弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL），为攻克其治疗难题提供了关键的理论依据和潜在的治疗策略，对推动 DLBCL 的精准治疗具有重要意义。

一、研究背景

DLBCL 作为最常见的淋巴瘤类型，虽然一线联合化疗免疫疗法对部分患者有效，但复发或难治性（rel/ref）患者的预后依旧很差。B 细胞受体（BCR）下游信号传导在 DLBCL 进展中起着关键作用，尤其是活化 B 细胞（ABC）起源的肿瘤，需要 CARD11 - BCL10 - MALT1（CBM）复合物激活 NF - κB。在 DLBCL 中，存在众多导致 CBM 激活的基因组改变，然而，突变和信号传导的异质性阻碍了靶向信号抑制剂在 DLBCL 治疗中的应用。

近年来，BCL10 功能获得性突变成为 DLBCL 中 CBM 激活的新驱动因素，这类突变约在 5% 新诊断的 DLBCL 患者中出现，且在 ABC 富集的 LymphGen BN2/Chapuy C1 病例中聚集。BCL10 突变不仅介导对布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂的耐药，还使肿瘤对多种其他药物产生抗性，因此，探索针对 BCL10 突变驱动的 DLBCL 的有效治疗策略迫在眉睫。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与试剂

研究中使用的细胞系源自 ATCC 和合作方，并经过真实性验证。细胞实验所用化合物来源详见补充表 1。

（二）BCL10 突变体的克隆与过表达

运用 QuikChange II XL 定点突变试剂盒在 plvx Tetone 载体中构建 BCL10 突变体，通过转染 293 T 细胞产生病毒，依据 GFP 表达测定感染效率，并用嘌呤霉素筛选。

（三）竞争实验

将含有空载体、BCL10 野生型和突变体的 plvx - IRES - ZsGreen1 载体感染细胞，使用 Attune 细胞仪检测 GFP。细胞经 BTK 抑制剂处理 72 - 96 小时后，洗去药物使其恢复，重复该步骤两次，每 48 小时检测一次 GFP。

（四）细胞活力与协同作用检测

在 96 孔板（每孔 5000 个细胞）或 384 孔板（每孔 1000 个细胞）中进行系列药物稀释培养细胞，利用 Cell Titer Glo 检测细胞活力，通过 GraphPad Prism 进行非线性拟合回归分析得出，并在特定网站计算 Bliss 协同评分。

（五）双荧光素酶报告基因实验

在 12 孔板中接种个 293 T 细胞，24 小时后用 Lipofectamine 转染 50 ng NFκB、25 ng 海肾荧光素酶和 50 ng 目的质粒，孵育 40 小时后使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测。

（六）其他实验方法

研究还运用了 EGFP NF - κB 报告基因实验、蛋白质免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、磷酸激酶和细胞因子阵列、RNA 测序及分析、药物筛选、体内实验、线粒体膜电位检测、定量实时 PCR、组织学和免疫组化等多种实验技术，从不同层面探究 BCL10 突变在 DLBCL 中的作用机制及相关治疗策略的效果。

三、研究结果

（一）BCL10 突变对基因表达的影响

研究人员在 ABC - DLBCL 细胞系中构建了 BCL10 功能获得性突变系统，通过 RNA 测序发现，BCL10 突变体（S136X 和 R58Q）与空载体样本相比，基因表达存在显著差异。突变体激活了 NF - κB 信号通路，使 TNFα 产生增加，还影响了凋亡相关基因，包括 BCL2 家族成员的表达。同时，对未治疗的 DLBCL 患者 RNA 测序数据的分析也证实，BCL10 突变病例中关键 TNFα 相关基因存在失调，这表明 BCL10 突变广泛重塑了 DLBCL 的生物学特性。

（二）BCL10 突变促进致癌细胞因子的产生

基因本体（GO）分析显示，BCL10 突变体中细胞因子介导的信号传导是上调最显著的过程。在众多细胞因子中，IL - 6、IL - 7、CCL22 等细胞因子在突变体中表达增加，且在 BCL10 突变患者的肿瘤中也显著上调。ELISA 实验进一步证实了 TNFβ、IL - 6 等细胞因子的激活，这表明细胞因子产生是 BCL10 激活突变下游的淋巴瘤发生机制，对自分泌刺激和淋巴瘤微环境重编程具有重要意义。

（三）BCL10 突变使多种转录因子失调

对 BCL10 突变体中上调基因的分析发现，有 16 种转录因子与之相关，包括 NF - κB（RELA 和 IRF4）、AP - 1（JUN 和 JUND）、ERK1/2 介导的转录因子 CEBPB、ETS1、SPI1，以及由干扰素（STAT1、STAT2、PRDM1）和 IL7（EBF1、BCL11A）介导的转录因子。患者数据和 Western blot 实验均验证了这些关键转录因子的上调，同时还发现 IFNγ 信号通路相关的 CXCL10 产生增加，这表明 BCL10 突变通过激活多种转录因子，促进了基因表达的重编程。

（四）BCL10 突变阻碍多种药物的疗效

研究证实 BCL10 突变会导致对共价和非共价 BTK 抑制剂的抗性。通过对 960 种化合物的 TargetMol 表观遗传文库进行筛选，发现 BCL10 突变体对多种药物存在抗性，如 PI3K/AKT 抑制剂、BCL2 抑制剂维奈托克（venetoclax）、mTOR 抑制剂和 PIM 激酶抑制剂等，这些药物在其他 B 细胞淋巴瘤治疗中有效，但对 BCL10 突变驱动的 DLBCL 效果不佳，这表明 CBM 复合物的激活在临床对特定药物类别的抗性中起关键作用。

（五）BTK 抑制使 BCL10 突变肿瘤对维奈托克敏感

尽管 MALT1 蛋白酶抑制剂对 BCL10 突变细胞有一定效果，但存在反馈激活 PI3K - AKT 信号通路等潜在混杂效应。研究发现，维奈托克与 BTK 抑制剂或 PI3K 抑制剂联合使用时，无论突变状态如何，都呈现出相加或协同作用。其中，维奈托克与 pirtobrutinib 联合使用在体外和体内实验中均表现出协同杀伤 BCL10 突变淋巴瘤细胞的效果，能使肿瘤完全消退，且未产生明显毒性，这表明 BTK 在促进药物抗性中起关键作用，抑制 BTK 可与维奈托克协同克服这种抗性。

（六）维奈托克关键抗性因子的表达依赖于 BTK

BCL10 突变体中 BCL2 家族成员 BCL2L1、BCL2A1 和 BCL2 的表达显著增加，这是对单药维奈托克抗性的重要原因。而 pirtobrutinib 处理后，这些抗性因子的表达显著下降，尽管 BCL10 突变细胞对 pirtobrutinib 存在抗性，但这种处理降低了细胞的凋亡阈值。线粒体膜电位检测和 Western blot 实验表明，维奈托克和 pirtobrutinib 联合使用能有效诱导细胞凋亡，这说明即使 BCL10 突变激活 CBM 复合物导致对 BTK 抑制剂抗性，BTK 仍对保护肿瘤细胞免于凋亡至关重要，抑制 BTK 可克服这种保护作用。

（七）BCL10 突变肿瘤中多个下游通路依赖于 BTK

在 BCL10 突变肿瘤中，IL6 - JAK - STAT3 等信号通路失调，STAT3 激活与抗凋亡基因上调相关。研究发现，IL6 的表达和产生、STAT3 的激活以及 PI3K/AKT 和 MAPK 通路的激活均对 pirtobrutinib 敏感。通过 CRISPR/Cas9 编辑构建的内源性 BCL10 单等位基因突变系统也证实，BTK 抑制剂与维奈托克联合使用可克服 BTK 抗性，这表明尽管 BCL10 突变可导致 NF - κB 的 BTK 非依赖性激活和对 BTK 抑制剂的抗性，但肿瘤细胞仍依赖 BTK 维持关键通路的激活。

四、研究结论与讨论

该研究深入探讨了 BCL10 突变在 DLBCL 中的作用机制及潜在治疗策略。研究结果验证并详细阐述了 BCL10 突变导致 BTK 抑制剂抗性的现象，还发现这些突变使肿瘤对多种在 DLBCL 临床试验中失败的药物产生抗性。通过细胞模型和临床病例基因表达数据，揭示了细胞因子增强的正反馈环在 BCL10 突变背景下驱动淋巴瘤发生的机制。

尽管之前研究发现 BCL10 突变驱动的肿瘤对破坏 MALT1 副胱天蛋白酶活性和抑制表观遗传擦除剂 LSD1 有一定敏感性，但单独或联合使用这些方法的效果并不理想。研究人员最终聚焦于联合靶向 BTK 和 BCL2，发现 BCL10 突变肿瘤虽对两者单独使用存在抗性，但它们的联合使用却能产生协同作用。非共价 BTK 抑制剂 pirtobrutinib 可显著降低 BCL2 家族成员的表达，影响线粒体相关蛋白，表明 BTK 在保护细胞免于凋亡中起关键作用，即使在 CBM 激活的情况下也是如此。

与此同时，临床正在评估新型联合方案 ViPOR，其包含维奈托克和 BTK 抑制剂（伊布替尼）等药物，初步结果显示在非 GCB 病例中活性较高，这或许能为该研究的机制提供临床验证，但目前尚无法与 BCL10 功能获得性突变这一特定生物标志物直接关联。

该研究也存在一定局限性，如未充分研究对淋巴瘤微环境的影响，仅探讨了细胞因子的自分泌效应，未来需要免疫活性模型来研究其旁分泌效应。不过，总体而言，pirtobrutinib 联合维奈托克的方案在 DLBCL 治疗中展现出了潜力，值得进一步评估其临床实用性。这一联合方案有望克服 DLBCL 的复杂性，为患者带来新的希望，并且在免疫治疗的背景下，如 CAR - T 细胞治疗和免疫效应器结合的多价抗体治疗中，也具有潜在的应用价值。