研究背景
在全球致力于向生物基经济转型的大背景下,能够利用二氧化碳(CO2)或其衍生物生长的微生物受到了越来越多的关注。其中,β 变形杆菌 Cupriavidus necator H16(以前称为 Ralstonia eutropha H16)表现出巨大的潜力,它能通过卡尔文 - 本森 - 巴斯姆循环(Calvin–Benson–Bassham cycle)利用 CO2和氢气生长,还能以电化学 CO2还原产生的甲酸盐作为唯一碳源,将 CO2转化为有价值的化合物,是实现 CO2增值(CO2 valorisation)的理想微生物。
然而,C. necator H16 作为生物技术平台菌株的潜力尚未得到充分挖掘,其中一个重要原因是缺乏高效、简单且快速的基因组编辑工具。现有的基因删除或插入方法,如自杀载体系统,需要两个交叉事件,操作繁琐;Tn5 转座子会随机整合到细菌染色体上;RalsTron 系统虽作为随机内含子整合的替代方法,但也存在局限性。此外,近期开发的诱导型 CRISPR-Cas9 系统编辑效率虽高,但编辑协议耗时过长(超过一周);另一种基于 CRISPR 的更快的基因组编辑工具,编辑效率却较低。因此,开发一种高效、标准化且快速的基因组编辑工具对充分利用 C. necator H16 至关重要。
为了解决这些问题,来自英国牛津大学、丹麦技术大学等多个研究机构的研究人员开展了相关研究,其研究成果发表在《TRENDS IN Biotechnology》上。
研究方法
- 开发新系统:研究人员开发了 Self-splicing Intron-Based Riboswitch-Cas9(SIBR-Cas9)和 SIBR2.0-Cas12a 两种基因组编辑工具,用于编辑 C. necator H16 的基因组。其中 SIBR2.0 还可用于控制嗜温原核生物中几乎任何基因的表达1。
- 验证系统功能:通过一系列实验验证 SIBR-Cas9 和 SIBR2.0-Cas12a 系统的功能,包括检测相关蛋白的表达、评估编辑效率等。实验涉及多种微生物菌株,如 C. necator ΔH16_A0006ΔphaC 和 Escherichia coli DH10B 等2。
- 开发相关脚本:开发名为 “SIBR Site Finder” 的 Python 脚本,用于寻找合适的位点引入 SIBR2.0,以优化基因组编辑工具6。
研究结果
- SIBR 控制 Cas9 表达:SIBR 能够紧密且诱导性地控制 C. necator 中 Cas9 的表达。研究人员通过四个检查点控制开发 SIBR-Cas9 系统,在验证了相关启动子、诱导剂浓度、Cas9 功能及 SIBR 系统诱导性后,使用 SIBR-Int4-Cas9 在两个基因组位点(glcEF 和 acoC)实现了 > 80% 的编辑效率,且在电穿孔后 48 小时内即可完成34。
- CRISPR-Cas12a 功能验证:CRISPR-Cas12a 在 C. necator 中具有功能。通过组成型表达 Cas12a 和靶向 acoC 的 crRNA,与非靶向(NT)crRNA 对照相比,发现靶向 crRNA 能完全消除菌落,证明了 CRISPR-Cas12a 可用于 C. necator 的基因组靶向5。
- SIBR2.0 的开发:研究发现 SIBR 中存在一个替代翻译起始位点,导致 Cas12a 在无诱导剂时也能表达。为解决该问题并拓宽 SIBR 的应用范围,研究人员开发了 SIBR2.0。SIBR2.0 可沿目标基因的编码序列(CDS)引入,避免从替代 RBS 位点翻译出全长蛋白,即使翻译仍从该位点发生,也只会产生截短的、无功能的蛋白7。
- SIBR2.0-Cas12a 介导基因组编辑:使用 SIBR2.0 控制 C. necator 中 Cas12a 的表达,实现了对 acoC 基因的编辑,编辑效率约为 70%。这是首次成功使用 CRISPR-Cas12a 编辑 C. necator 的基因组,进一步扩展了该物种的基因组编辑工具库8。
- 快速高效的质粒清除:在基因组编辑后,研究人员测试了从编辑菌株中去除 SIBR 质粒的可能性。发现将编辑后的细胞在 37°C 的无抗生素 LB 培养基中培养,可实现高效的质粒清除,≥98% 的细胞群体在单次过夜(16 小时)孵育后对卡那霉素敏感,为迭代编辑或引入其他质粒提供了可能9。
研究结论与意义
本研究成功开发了 SIBR-Int4-Cas9 和 SIBR2.0-818-Cas12a 系统,简化了 C. necator 的基因组编辑流程,提高了编辑效率。通过使用这些系统,研究人员能够在电穿孔后约 48 小时内生成基因敲除的 C. necator 菌株,并在约 4 天内获得无质粒菌株用于下游应用或迭代编辑,与以往研究相比,时间至少缩短了 50%。此外,研究还开发了 SIBR Site Finder 脚本,可帮助用户找到合适的位点引入 SIBR2.0。
这些创新成果有望推动 C. necator 成为强大的微生物细胞工厂,加速其在生物技术领域从实验室规模到工业规模的应用转化。同时,SIBR2.0 系统的紧密和多功能特性,为在低内源性同源重组效率的微生物中进行基因组编辑、控制有毒蛋白质的表达以及构建遗传逻辑门和遗传电路开辟了新的途径。不过,目前该技术仍面临一些挑战,如茶碱诱导剂的高毒性、所得菌落数量少等,未来研究可针对这些问题进一步优化,以充分发挥该技术的潜力。