靶向 NKG2A/HLA-E 轴逆转急性髓系白血病复发患者 NK 细胞耗竭的新策略

时间：2025年5月6日

来源：Signal Transduction and Targeted Therapy

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急性髓系白血病（AML）复发预后差，NK 细胞治疗易致细胞耗竭。研究人员探究 AML 患者 NK 细胞耗竭机制，发现 NKG2A/HLA-E 轴过度激活及 PI3K-AKT 通路抑制导致 NK 细胞耗竭，靶向该轴可恢复通路信号并逆转耗竭，为免疫治疗提供新思路。

在血液癌症的 “战场” 上，急性髓系白血病（AML）是成人中常见的急性白血病类型。对于 60 岁以下的患者，约 35 - 45% 能实现长期生存，但 60 岁以上患者的这一比例急剧降至 10 - 15%。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法和过继性自然杀伤（NK）细胞输注，在多种癌症治疗中展现出显著疗效，然而在 AML 治疗中却受到诸多限制。这是因为 AML 具有疾病异质性，缺乏专属抗原，且肿瘤微环境复杂，免疫抑制作用强。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是 AML 的有效治疗手段，可疾病复发仍是导致移植失败、影响患者生存的主要风险因素。因此，深入了解 AML 进展过程中免疫细胞的特征，对提高免疫治疗效果至关重要。

NK 细胞作为 allo-HSCT 后首批重建的淋巴细胞，在白血病免疫监测中发挥着关键作用。已有研究表明，原发性 AML 患者的 NK 细胞存在功能障碍，表现为细胞毒性降低，激活受体如 NKp30、NKp46 和 NKG2D 表达下调等。此外，NK 细胞功能障碍涵盖多种状态，包括衰老、抑制和耗竭。与 T 细胞耗竭类似，NK 细胞在慢性抗原刺激下也会发生耗竭。此前研究发现，多种抑制性受体如 TIGIT、Tim3、PD-1 和 NKG2A 等参与了 AML 中 NK 细胞的功能障碍，但 NK 细胞耗竭是否由 NKG2A/HLA-E 相互作用过度激活所致尚不清楚。同时，磷脂酰肌醇 - 3 - 激酶（PI3K）-AKT 通路在 NK 细胞的发育、成熟、启动和细胞毒性功能中起重要作用，该通路异常会降低 NK 细胞对肿瘤的细胞毒性，但 NKG2A/HLA-E 轴与 PI3K-AKT 信号通路在 NK 细胞中的潜在相互作用尚未明确。

为了解决这些问题，北京大学人民医院、北京大学 - 清华生命科学中心等机构的研究人员开展了一项系统性研究。研究发现，AML 细胞通过过度激活 NKG2A/HLA-E 轴和抑制 PI3K-AKT 通路，导致 NK 细胞耗竭。靶向 NKG2A/HLA-E 轴有望恢复 PI3K-AKT 信号传导，逆转 NK 细胞耗竭，为 AML 免疫治疗提供了新的策略。该研究成果发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：

样本采集与细胞培养：收集了 12 名健康供者、30 名 allo-HSCT 后复发的 AML 患者和 30 名 allo-HSCT 后完全缓解的 AML 患者的骨髓单核细胞（BMMCs）。使用多种细胞系，包括 NK92、K562、THP1 等进行体外实验。
流式细胞术分析：检测 NK 细胞的表面标志物、配体表达以及细胞内细胞因子和磷酸化蛋白水平，评估 NK 细胞的表型和功能。
RNA 测序（RNA-seq）：对健康供者、缓解患者和复发患者的 NK 细胞进行 RNA 测序，分析基因表达差异，确定相关信号通路的变化。
基因编辑技术：利用 Cas9-RNP 蛋白敲除 NK92 细胞和原代 NK 细胞中的 KLRC1 基因（编码 NKG2A），研究 NKG2A 缺失对 NK 细胞功能的影响。
动物模型实验：构建 AML 小鼠模型，包括 THP-1 - 荧光素酶细胞构建的白血病 NPG 小鼠模型和 HL-60 皮下异种移植小鼠模型，在体内评估 NK 细胞功能和治疗效果。

下面介绍具体的研究结果：

NK 细胞在复发 AML 患者中耗竭：研究人员对比了 60 例患者（30 例复发、30 例完全缓解）和 12 名健康供者的 NK 细胞。发现复发患者白细胞中 NK 细胞频率低于健康供者，但与完全缓解患者相当。复发患者中成熟的 CD56^dimNK 细胞亚群频率降低，而未成熟的 CD56^brightNK 细胞频率增加，不成熟 / 成熟 NK 细胞比例显著升高。此外，复发患者 NK 细胞的终末分化标志物（如 CD57 和 KIRs）表达下调，抑制性受体 NKG2A、Tim3 和 PD-1 表达上调，细胞毒性功能受损，这表明 NK 细胞在复发 AML 患者中发生了耗竭。
长期 AML 细胞刺激诱导 NKG2A 过表达和 NK 细胞耗竭：体外将 NK 细胞系（YT 或 NK92 细胞）与 AML 细胞系共培养，短期（24h）共培养对 NK 细胞功能影响不明显，但 5 天共培养后，NK 细胞的 CD107a 和 IFN-γ 分泌减少，T-bet 和 Eomes 表达降低，抑制性受体表达增加。原代 NK 细胞与 AML 细胞系共培养也得到类似结果，且 NKG2A 表达随共培养时间延长而持续增加。在 AML 细胞系异种移植小鼠模型中，体内持续暴露于白血病细胞也诱导了 NK 细胞功能耗竭。对复发患者治疗前后的随访评估发现，治疗缓解的患者 NK 细胞抑制性受体水平降低，细胞因子产生增加；而持续复发的患者 NKG2A 表达增加，NK 细胞细胞毒性略有下降。这些结果表明，长期 AML 细胞刺激导致 NKG2A 过表达，与 NK 细胞耗竭相关。
AML 母细胞上 HLA-E 的过表达与复发 AML 患者 NK 细胞耗竭相关：研究人员分析了健康供者、缓解患者和复发患者 CD34⁺CD45^dim+骨髓单个核细胞（BMNCs）上抑制性和激活性受体的配体谱。发现复发患者 HLA-ABC 表达降低，HLA-E 和 PD-L1 表达升高，且 HLA-E 表达与 NKG2A 表达相关。进一步对比原发性和复发性 AML 患者 AML 母细胞上的配体表达，发现原发性 AML 患者 HLA-ABC 表达低于复发性患者，而 HLA-E 和 PD-L1 表达则相反。此外，复发患者骨髓上清液中 IL-10、TNF-α 和 IFN-γ 等细胞因子水平显著升高，这些细胞因子可上调 AML 母细胞上 HLA-E 的表达。这表明多种炎症细胞因子刺激诱导白血病母细胞上 HLA-E 高表达，可能通过 NKG2A/HLA-E 相互作用导致 NK 细胞耗竭。
NKG2A/HLA-E 轴阻断增强 NK 细胞抗 AML 活性：鉴于 NKG2A 和 HLA-E 的过度相互作用与 NK 细胞耗竭有关，研究人员使用 NKG2A 阻断抗体（monalizumab）或 HLA-E 阻断抗体进行实验。结果显示，阻断 HLA-E 或 NKG2A 可有效降低 NK 细胞上 NKG2A 表达，增强 CD107a 表达，提高 NK 细胞的细胞毒性功能，促进转录因子表达，增加靶细胞凋亡。在白血病 NPG 小鼠模型中，体内阻断 NKG2A 可增强脾脏 NK 细胞对 THP1 细胞的细胞毒性，降低肝脏 NK 细胞中抑制性受体 LAG3、PD-1 和 TIGIT 的表达，延缓肿瘤生长，提高小鼠生存率。
NKG2A 基因敲除使耗竭的 NK 细胞恢复活力：研究人员利用 Cas9-RNP 蛋白敲除 NK92 细胞和原代 NK 细胞中的 NKG2A 基因。结果发现，NKG2A 敲除（NKG2A^KO）的 NK92 细胞细胞毒性增强，原代 NKG2A^KONK 细胞在与 THP-1 细胞共培养后，T-bet 表达升高，IFN-γ 释放增加，GZMB 和 Ki-67 表达上调，LAG3 表达降低。NKG2A^KO的 AML 来源 NK 细胞对高表达 HLA-E 的细胞（THP-1 细胞和 AML 母细胞）杀伤能力更强，诱导靶细胞凋亡率更高。将 NKG2A^KO的 AML 来源 NK 细胞输注到 THP-1 CDX 小鼠模型中，与其他组相比，肿瘤负荷更低，小鼠生存率更高。这表明 NKG2A 基因敲除是恢复 AML 患者 NK 细胞功能的有效方法。
PI3K-AKT 信号通路抑制与 AML 患者 NK 细胞耗竭有关：对健康供者、缓解患者和复发患者的 NK 细胞进行 RNA 测序分析，KEGG 富集分析和 GSEA 分析均表明，复发患者 PI3K-AKT 信号通路受到抑制。进一步研究发现，复发患者 PI3K-AKT 通路相关基因表达下调，AML 患者来源的 NK 细胞中 AKT、PI3K 及其磷酸化形式的表达水平显著低于对照 NK 细胞。体外实验中，与 AML 细胞系共培养的 NK92 细胞 PI3K-AKT 通路激活降低，使用 PI3K-AKT 抑制剂会加重抑制，而 PI3K 激活剂则有助于缓解抑制，增强 NK92 细胞功能。原代 NK 细胞实验也得到类似结果，表明 PI3K-AKT 通路激活剂可缓解 NK 细胞耗竭。
NKG2A/HLA-E 相互作用驱动耗竭 NK 细胞中 PI3K/AKT 抑制：在 HL-60 荷瘤小鼠中，发现 AML 刺激 2 周后，外周血 NK 细胞 NKG2A 表达升高，p-AKT 表达降低，且肿瘤负荷与 NKG2A 表达相关，NKG2A 表达水平与磷酸化 AKT 水平呈显著负相关。阻断 HLA-E 或敲除 NKG2A 可显著增加 NK 细胞中 AKT 的磷酸化水平，而使用 PI3K-AKT 抑制剂后，抗 NKG2A 或抗 HLA-E 抗体无法挽救 NK 细胞的抑制，表明 PI3K-AKT 是 NKG2A/HLA-E 轴的下游信号通路。干扰 NKG2A/HLA-E 轴可有效恢复肿瘤条件下 NK 细胞的活力，这可能与 PI3K-AKT 信号激活的恢复有关。

综合上述研究，该研究揭示了 AML 细胞通过过度激活 NKG2A/HLA-E 轴，抑制 PI3K-AKT 通路，导致 NK 细胞耗竭的机制。研究表明，靶向 NKG2A/HLA-E 轴，无论是通过阻断还是基因敲除的方式，都可能缓解 NK 细胞耗竭，恢复其功能，为 AML 免疫治疗提供了新的潜在靶点和策略。然而，研究也存在一些局限性，如缺乏 NK 细胞耗竭与复发 AML 中炎症细胞因子暴露直接相关的实验证据，联合免疫治疗效果有限等问题。未来研究可进一步探究相关机制，优化治疗策略，为 AML 患者带来更多希望。