大脑，这个人体中最为神秘复杂的器官，犹如一座精密的超级计算机，神经元之间的连接如同错综复杂的电路，承载着人类的思维、情感和行为等诸多奥秘。在探索大脑奥秘的征程中，连接组学的发展至关重要。它旨在绘制神经元之间的连接图谱，揭示大脑信息处理的机制。然而，目前的研究手段存在诸多挑战。电子显微镜（EM）虽能以纳米级分辨率进行密集的连接组分析，但在获取分子信息方面存在局限，无法直接可视化特定分子，且样本制备和读出过程复杂，难以与分子信息直接关联。光镜（LM）虽具有独特的可视化特定分子的能力，但传统光镜分辨率有限，难以区分密集标记的细胞结构，无法实现突触水平的电路重建。在这样的背景下，开展一项能够突破现有技术局限的研究迫在眉睫。
奥地利的研究人员肩负起这一使命，开展了基于光镜的连接组学（LICONN）技术研究。他们通过整合专门设计的水凝胶嵌入和扩张技术，以及基于深度学习的全面分割和连接性分析，成功实现了将分子信息直接融入脑组织的突触水平重建。这一研究成果意义非凡，发表在《Nature》杂志上。它为研究大脑功能提供了一种强大的工具，有助于深入理解神经元之间的连接模式和信息传递机制，对神经科学领域的发展具有深远影响。
研究人员采用了以下几个主要关键技术方法：一是水凝胶嵌入和扩张技术，通过优化灌注、化学固定和水凝胶组成等步骤，实现组织的高保真扩张，提高分辨率；二是深度学习算法，运用洪水填充网络（FFN）进行神经元结构的自动分割和突触位置的预测；三是免疫标记技术，用于可视化特定蛋白质，识别不同类型的突触和细胞结构。
下面来详细了解一下研究结果：
- 脑组织的扩张用于连接组学研究：研究人员开发了一种迭代扩张技术，通过优化水凝胶的组成和处理步骤，实现了约 16 倍的组织扩张，且机械性能稳定。经该技术处理的脑组织，在亚细胞结构的成像上表现出色，能清晰呈现线粒体、高尔基体和初级纤毛等结构，同时在突触处观察到与电子显微镜数据相似的蛋白质密集特征，这表明该扩张和成像过程能从组织尺度到纳米尺度高保真地反映脑组织的细胞成分。
- LICONN 中神经元结构的追踪：研究人员通过与稀疏荧光标记对比，验证了手动追踪的可靠性。在对轴突和树突的追踪实验中，结果显示 LICONN 数据具有高可追溯性，排除了大量不可追踪的 “孤儿” 棘突的存在。此外，手动重建神经元结构的实验表明，LICONN 适用于详细的体积注释，尽管手动重建存在扩展性差的问题，但这也为后续自动化分析提供了基础。
- 利用洪水填充网络进行自动分割：研究人员训练 FFN 对更大体积的脑组织进行分析，通过优化分割算法和手动校对，实现了与当前最先进的电子显微镜结果相媲美的自动分割精度。这一成果使得在纳米尺度上详细揭示神经元结构的复杂三维排列成为可能，为深入研究神经元之间的连接提供了有力支持。
- 分子注释的连接组学：利用光镜可视化特定分子的能力，研究人员通过免疫标记在结构背景下可视化突触蛋白，精确测量了突触蛋白之间的距离，并将突触分子机制定位到相应的神经元结构上。这一发现为理解突触的功能和分子组成提供了直接证据，有助于深入探究神经元之间的信号传递过程。
- 分子推断的突触连接性：研究人员基于免疫标记开发了一种自动突触识别管道，通过该管道能够准确识别兴奋性和抑制性突触，并将分子定义的突触连接性映射到自动形态重建上。这一成果为研究神经元之间的连接模式和信息传递方向提供了重要依据，有助于构建更加准确的大脑连接组模型。
- 兴奋性和抑制性突触的识别：通过对抑制性突触标记蛋白 gephyrin 的免疫标记，研究人员能够清晰地区分兴奋性和抑制性突触。这一发现对于理解大脑中兴奋和抑制的平衡机制至关重要，为进一步研究神经系统疾病的发病机制提供了新的视角。
- 连接性分析：研究人员通过对特定脑区的成像和分析，详细研究了突触连接的基本参数，包括抑制和兴奋的比例。结果显示，兴奋性输入主要集中在棘突头部，而抑制性输入在轴突和树突的不同部位具有不同的分布特点。这一成果为理解大脑的信息处理和神经回路的功能提供了关键数据。
- 基于深度学习的突触位置预测：为克服显微镜硬件和成像时间的限制，研究人员利用深度学习从结构数据中预测突触分子的位置。实验结果表明，该预测方法具有较高的准确性，能够在无免疫标记的数据集上成功映射突触输入场，为大规模连接组学研究提供了一种高效的方法。
- 细胞类型和亚细胞结构的识别：结合结构和分子信息，研究人员不仅能够准确分类细胞类型，还能通过分子标记明确亚细胞结构的身份，如 AIS 和髓鞘化轴突等。此外，对初级纤毛的研究发现，Hnrnpu 基因突变对海马神经元初级纤毛长度无明显影响，这一结果对于理解神经发育疾病的机制具有重要意义。
- 间隙连接的分子识别：研究人员通过免疫标记 connexin - 43，成功可视化了星形胶质细胞之间的电连接和细胞伙伴，同时结合其他标记实现了在同一电路中同时映射兴奋性、抑制性和电连接性。这一成果为研究大脑中的电信号传递和神经胶质细胞的功能提供了新的方法和视角。
- 成像体积的无损轴向扩展：为扩大成像范围，研究人员实施了块面成像方法，通过对扩展水凝胶的切片和成像，实现了成像体积的轴向扩展，使神经元结构能够在不同成像层之间连续追踪。这一技术突破为全面分析细胞连接性提供了可能，有助于构建更完整的大脑连接组图谱。
在结论和讨论部分，LICONN 技术展现出显著的优势。与传统的电子显微镜技术相比，它不仅能够实现可靠的神经元结构追踪和自动重建，还能直接测量空间分辨的分子信息，包括特定蛋白质、电突触和关键亚细胞特征等。虽然目前获取的组织体积相对有限，但通过水凝胶切片和轴向扩展等技术手段，有望实现更大体积的成像。此外，LICONN 技术还可通过整合空间转录组学方法，进一步扩展其分子信息内容，为多模态描述哺乳动物脑细胞提供可能，包括形态、连接性、生理学和基因表达等方面。该技术在研究神经发育疾病的基因型 - 表型关系和细胞改变方面也具有重要应用价值，并且有望在其他需要高分辨率组织分析的器官和系统研究中发挥作用。总之，LICONN 技术为连接组学研究提供了一种高度可及且强大的工具，为神经科学领域的发展开辟了新的道路，具有广阔的应用前景。
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