杆状病毒表达载体系统中工程化温度开关实现病毒样颗粒疫苗的高效生产与污染物最小化

时间：2025年5月11日

来源：TRENDS IN Biotechnology

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为解决杆状病毒表达载体系统(BEVS)生产病毒样颗粒(VLPs)时杆状病毒颗粒(BV)污染难题，研究人员通过突变gp41基因构建温度敏感型(ts)杆状病毒BacFreetsts。该系统在27°C高效扩增病毒，33°C则关闭BV分泌，实现CHIKV、WNV等VLPs生产时BV污染降低99.97%，为疫苗下游加工(DSP)提供革新方案。

论文解读

背景与挑战
病毒样颗粒(VLPs)因其安全性与免疫原性成为疫苗研发的热门选择，但利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)生产时，共分泌的杆状病毒颗粒(BV)因与VLPs物理性质相似，导致下游纯化(DSP)困难。传统方法需复杂处理或化学灭活，可能损害抗原性。例如，HPV疫苗需解聚再组装，而复杂VLPs如基孔肯雅病毒(CHIKV)的包膜VLPs(eVLPs)无法采用此策略，限制了BEVS的商业化应用。

研究动机
荷兰瓦赫宁根大学团队领衔的研究旨在开发一种无需基因删除或互补细胞系的解决方案——通过温度调控BV分泌的“开关”。此前，删除BV必需基因(如VP80或GP64)虽能阻断BV产生，但需高感染复数(MOI)且伴随细胞毒性。而温度敏感型(ts)突变体可通过简单升温抑制BV污染，同时保留BEVS的灵活性与规模化潜力。

技术方法
研究基于ts-B1074突变体（GP41的I317T突变），通过同源重组构建BacFreets^ts载体，结合AlphaFold3预测GP41结构。实验采用悬浮培养的Sf9和High Five细胞，通过qPCR、Western blot、透射电镜(TEM)及ELISA评估BV抑制效果与VLPs产量，并在3L生物反应器中验证工艺可放大性。

研究结果

1. 设计ts杆状病毒表达系统

温度开关验证：BacFreets^ts在27°C产生>10⁸ TCID₅₀/ml的BV，33°C时BV滴度下降99.94%（仅0.2 TCID₅₀/细胞），电镜显示核衣壳滞留于核膜，无法形成BV或ODV。
启动子活性：polh和p10启动子在33°C转录活性降低，但VLPs产量受影响较小（如FMDV VLPs反增74%）。

2. 多病原体VLPs生产

CHIKV eVLPs：BV污染降低>99.99%，但E2蛋白产量减少70%。
WNV eVLPs：通过E蛋白A261C突变稳定二聚体，BV减少99.7%，产量无显著差异。
CVA6 VLPs：在High Five细胞中BV降低99.26%，但正确折叠VLPs减少56%。
FMDV VLPs：BV下降99.97%，VP2产量提升，凸显兽医疫苗应用潜力。

3. 规模化兼容性
低MOI（0.01 TCID₅₀/细胞）结合40 hpi时升温至34°C，可实现完全感染且BV减少100倍，适用于工业级生物反应器。

结论与意义
BacFreets^ts通过单氨基酸突变实现温度依赖的BV分泌抑制，大幅简化VLPs纯化流程。其兼容现有BEVS组件（如Bac-to-Bac转移载体），且无需高MOI，技术成熟度达TRL4（技术就绪水平4）。尽管高温可能影响部分VLPs产量，但通过启动子优化或细胞系适配可进一步改进。该研究为人类和兽用疫苗生产提供了兼具成本效益与合规性的解决方案，推动BEVS在复杂生物制剂领域的竞争力。

未来方向
需验证33°C生产的VLPs生物物理特性是否等同27°C产物，并开发针对残留BV的灭活或去除技术。精确控温（±0.1°C）在工业规模的应用将是技术转移的关键挑战。