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本研究通过创新性BRET技术和单分子追踪，揭示了WNT配体诱导Frizzled(FZD)与LRP6受体结合的新机制：尽管WNT-16B能有效促进FZD-LRP6结合，却无法触发经典的WNT/β-catenin信号级联。研究提出"两步检查点"模型，指出受体高阶簇形成和LRP6磷酸化是β-catenin信号激活的关键限速步骤，为靶向WNT通路药物开发提供了新视角。
在胚胎发育和组织稳态中，WNT/βcatenin信号通路如同精密编排的交响乐，而Frizzled(FZD)受体和LRP5/6共受体就是这场演出的首席乐手。尽管科学界早已确立"WNT诱导FZD-LRP6结合启动下游信号"的经典理论，但不同WNT配体引发的生物学效应差异始终是个谜团。更令人困惑的是，人工设计的WNT替代物(WNT surrogates)能通过简单交联FZD与LRP6就激活通路，这与天然WNT的复杂调控形成鲜明对比。这些矛盾暗示着：受体结合与信号激活之间可能存在着尚未发现的"检查点"机制。
瑞典卡罗林斯卡学院的Jan Hendrik Voss、Zsombor Koszegi等跨国团队在《Nature Communications》发表的重要研究，运用生物发光共振能量转移(BRET)和活细胞单分子成像等前沿技术，首次揭示WNT-16B能诱导FZD-LRP6结合却不激活βcatenin信号的奇特现象。研究人员通过构建NanoLuc/Venus标记的受体探针，建立动态监测FZD5-LRP6相互作用的BRET体系，结合磷酸化检测、转录组分析和单粒子追踪等技术，系统比较了WNT-3A与WNT-16B的信号激活差异。
直接NanoBRET技术捕捉FZD5-LRP6动态结合
通过C端标记NanoLuc的FZD5和Venus标记的LRP6，研究证实WNT-3A刺激可诱导显著的BRET信号增强，而组成型相互作用几乎检测不到。值得注意的是，LRP6 C端磷酸化位点突变体(LRP6-5A)虽丧失信号传导能力，却仍保持正常的WNT诱导结合特性，表明受体结合与磷酸化是两个独立事件。
DVL变构调节受体复合物构象
当在DVL1-3敲除细胞中，WNT-3A诱导的ΔBRETmax显著增强，而重新导入野生型DVL2可恢复这一表型。有趣的是，不能结合FZD的DVL2 L445E突变体则无此功能，提示DVL通过DEP结构域与FZD相互作用，变构调节FZD-LRP6复合物的空间排列。
WNT-16B的特殊信号特性
在FZD4/5/7中，WNT-16B虽能诱导明显的BRET响应，却既不引起LRP6 S1490磷酸化，也不激活TCF/LEF报告基因。转录组分析显示，WNT-16B和WNT-3A诱导截然不同的基因表达谱，暗示它们通过不同下游通路发挥作用。特别引人注目的是，尽管WNT-16B能增加受体限制性运动，但单分子成像显示其无法像WNT-3A那样促使受体形成高阶簇。
单分子成像揭示受体集群差异
在CHO-K1细胞中，SNAP-FZD5和Halo-LRP6的实时追踪显示：WNT-3A晚期刺激(11-25分钟)诱导受体形成含2-8个分子的簇，而WNT-16B处理组中约60%受体保持单体状态。光漂白步进分析进一步证实，WNT-3A促进的受体簇中FZD5与LRP6以近似1:1化学计量比组合。
LRP6磷酸化非簇形成前提
使用LRP6-5A突变体的实验证明，即使缺乏所有磷酸化位点，WNT-3A仍能诱导受体高阶簇形成，只是簇规模和结合速率略有降低。这表明LRP6磷酸化是信号传导的后续事件，而非簇形成的驱动因素。
这项研究从根本上重塑了人们对WNT信号启动机制的理解。提出的"两步检查点"模型指出：初始的FZD-LRP6结合只是信号激活的第一道门槛，必须通过"形成高阶受体簇"和"LRP6磷酸化"两道质量检查，信号才能有效传导至βcatenin通路。这一发现不仅解释了为何WNT-16B等配体虽能结合受体却无法激活经典通路，更为靶向WNT信号的治疗策略提供了新思路——单纯促进受体结合可能不够，还需确保下游检查点的顺利通过。该研究对癌症、肺纤维化等WNT相关疾病的精准治疗具有重要指导价值。
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