TCF-LEF/β-catenin信号通路揭示羊膜动物初级与次级肌管谱系早期分化的分子机制

本研究通过TCF-LEF/β-catenin信号报告系统结合精确体内电穿孔技术，首次解析了禽类胚胎肢体肌肉发育中初级肌管（primary myotubes）与次级肌管（secondary myotubes）的谱系起源难题。研究发现两个独立存在的祖细胞群体：报告基因阳性细胞专分化为表达慢肌球蛋白的初级肌管，而阴性群体产生快肌球蛋白的次级肌管和卫星细胞（satellite cells）。该成果为理解肌肉纤维多样性形成机制提供了全新分子框架，发表于《Nature Communications》。

在脊椎动物肌肉发育领域，一个困扰研究者半个世纪的谜题是：为何羊膜动物的骨骼肌会分两波形成？早期形成的初级肌管（primary myotubes）表达慢肌球蛋白（slow myosin），而后期出现的次级肌管（secondary myotubes）仅表达快肌球蛋白。这两类肌管是否同源？它们与成体肌肉干细胞（satellite cells）有何关联？这些问题直接关系到肌肉纤维类型多样性的发育起源，却长期缺乏分子水平的解释。

Gauthier Toulouse团队在《Nature Communications》发表的研究中，通过创新性的技术组合揭开了这一谜底。研究人员利用禽类胚胎模型，将TCF-LEF/β-catenin信号通路报告系统与精确定时电穿孔技术相结合，首次实现了从胚胎迁移期到胎儿期的连续谱系追踪。这项工作的突破性在于发现了两个从发育起始就独立存在的肌源性祖细胞群体：一类是持续激活Wnt/β-catenin信号通路的"报告阳性"细胞，另一类是不激活该通路的"报告阴性"细胞。

关键技术方法包括：1）构建含16个TCF/LEF结合位点的动态报告系统（16TF-VNP）；2）开发新型Tet-on/Cre-Lox谱系追踪工具TCF-Trace；3）单细胞RNA测序分析鸡胚胎肢体肌祖细胞；4）通过显性负性LEF1（DN Lef1）操纵信号通路；5）杂交链式反应（HCR）荧光原位杂交检测CXCR4表达。

研究结果部分的重要发现包括：

【TCF-LEF/β-catenin dependent signaling is restricted to early limb muscle development】

通过时间序列分析发现，TCF/β-catenin信号活性严格局限于PAX3⁺/PAX7⁺/MYF5⁺的增殖期肌祖细胞，当细胞开始表达MYOD并退出细胞周期时，信号立即关闭。这一发现解释了为何既往研究难以捕捉该通路的动态变化。

【TCF-Trace, a dynamic lineage tracing system】

创新的TCF-Trace系统通过将PEST降解信号与翻译增强元件结合，实现了对短暂激活TCF/β-catenin信号的细胞进行永久标记。该系统显示98%的标记效率，为动态发育研究树立了新标准。

【Two distinct progenitor populations co-exist in early limb myogenesis】

单细胞转录组证实存在两个转录特征迥异的群体。报告阳性细胞高表达Wnt靶基因（如LEF1）和迁移调控因子（如CXCR4），而阴性群体富集Wnt抑制因子。引人注目的是，人类胚胎肢体单细胞数据也显示出相似的表达模式，暗示跨物种保守性。

【TCF-LEF/β-catenin⁺ myogenic precursors differentiate into primary myotubes】

谱系追踪显示，所有慢肌球蛋白（MYH7B⁺）的初级肌管均来源于TCF-Trace⁺祖细胞，这些肌管在E9.5已形成，且不依赖神经支配。这一发现推翻了"初级肌管作为次级肌管形成支架"的假说。

【TCF-LEF/β-catenin signaling controls progenitor distribution via Cxcr4】

通过DN Lef1实验证实，Wnt信号通过转录调控CXCR4受体来指导祖细胞迁移。当信号被抑制时，肌祖细胞无法正常分散，在肢体近端形成异常聚集，这解释了初级肌管空间分布模式的分子基础。

这项研究的意义在于：1）解决了40年来关于肌管谱系起源的争议，证实初级与次级肌管源自两个独立谱系；2）揭示了卫星细胞与次级肌管同源的重要生物学规律；3）建立的TCF-Trace技术为发育生物学研究提供了通用工具；4）发现CXCR4介导的迁移调控机制，为理解肌肉模式形成提供新视角。该成果不仅重塑了对肌肉发育的认知，更为肌肉再生医学和肌病治疗提供了新的分子靶点。