编辑推荐：
本研究针对mTORC1激活过程中RHEB浓度矛盾与信号整合机制不明的关键问题，通过冷冻电镜技术解析了mTORC1-RHEB-RAG-Ragulator复合物在膜上的全原子结构，揭示了溶酶体膜通过降低空间维度促进RHEB与mTORC1结合的物理机制，并首次发现了mTOR和RAPTOR与膜的直接相互作用对激酶完全激活的关键作用，为靶向mTOR通路的疾病治疗提供了革命性结构见解。
在细胞生长与代谢调控的核心地带，有一个被称为"雷帕霉素机械靶标复合物1"（mTORC1）的关键分子机器。它如同一个智能指挥中心，整合生长因子和营养信号来决定细胞是应该积极合成蛋白质进行生长，还是启动自噬过程进行自我降解。然而，这个精密系统的调控机制中存在着令人困惑的谜题：作为mTORC1最主要激活剂的RHEB GTP酶，在体外实验中需要超过100微摩尔的浓度才能激活mTORC1，但在细胞内其生理浓度仅有约650纳摩尔，两者相差超过150倍！这种巨大的浓度差异如何解释？细胞又是如何巧妙地整合生长因子和营养信号来精确控制mTORC1的活性？
更令人费解的是，尽管生长因子信号起源于细胞膜，但RHEB对mTORC1的信号传递却专门发生在溶酶体的细胞质表面。当氨基酸充足时，RAG GTP酶会通过Ragulator复合物将mTORC1招募到溶酶体膜上，使其接近膜结合的RHEB-GTP池。这种对溶酶体定位和RHEB结合的双重依赖性，构成了一个逻辑"与门"，确保只有在生长因子信号和充足生物合成前体同时存在时，才能启动蛋白质合成和细胞生长。但这个生理上至关重要的"与门"在结构水平是如何组织和实现的，一直是个未解之谜。
来自美国加州大学伯克利分校的James H. Hurley团队与意大利Telethon遗传与医学研究所的Andrea Ballabio团队合作，在《Nature》杂志上发表了他们的突破性发现。研究人员提出假设：溶酶体膜本身可能是协调这个"与门"并弥补RHEB-GTP激活mTORC1所需浓度差距的关键因素。为了验证这一假设，他们采用了一项关键技术——原子级单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）来解析脂质体结合的外周蛋白组装体的结构。
研究团队首先建立了一个包含大型单层囊泡（LUVs）的体外重组系统，模拟溶酶体膜环境。他们使用脂质组成包括72.8% DOPC、7% POPS、10%胆固醇、5% DGS-NTA、5% PE MCC和0.2% DiR的LUVs作为膜平台，通过组氨酸标签将活性RAGGTP-RAGGDP-Ragulator复合物招募到膜上，同时通过巯基-马来酰亚胺反应将RHEB锚定在膜上。在这个接近生理浓度的系统中，他们监测了mTORC1对全长4E-BP1的Thr37和Thr46磷酸化的激酶活性。
实验结果显示，在LUVs、RAG-Ragulator和RHEB-GTP同时存在的情况下，mTORC1激酶活性增加了35倍以上，而单独使用可溶性RHEB-GTP则无法激活mTORC1，这与之前需要超过100微摩尔可溶性RHEB-GTP才能激活的报道一致。这表明脂质体与膜锚定的RHEB和RAGA-RAGC-Ragulator协同作用，有效激活了mTORC1对4E-BP1的磷酸化。
研究团队成功重组了mTORC1-RHEB-RAG-Ragulator与全长底物4E-BP1复合物在脂质体上的结构，并通过冷冻电镜技术解析了整个组装体的结构，整体分辨率达到3.23埃。二维分类平均显示该复合物相对于磷脂双层膜呈现刚性取向。
与无膜条件下解析的结构相比，膜结合的mTORC1-RHEB结构中的RAPTOR亚基发生了约7°的旋转，朝向mTOR的HEAT结构域。这种旋转运动与从apo-mTORC1到可溶性mTORC1-RHEB的转变一致，表明膜在RHEB结合后进一步塑造了mTORC1的构象。
研究人员通过局部细化获得了mTOR-RHEB-MLST8和RAPTOR-RAG-Ragulator亚复合物的冷冻电镜密度图，分辨率分别达到3.12埃和2.98埃，从而能够建立整个组装体的原子详细模型。高分辨率冷冻电镜密度确认了RAG GTP酶的活性状态，并观察到了肌醇六磷酸的密度，被mTOR FAT结构域中的赖氨酸-精氨酸簇包围。
冷冻电镜重建显示，除了预期的脂化LAMTOR1和RHEB的膜附着外，mTOR和RAPTOR亚基也直接与膜相互作用。RHEB的最后可见残基Ala173位于高变结构域中间，表明部分折叠的高变结构域和一个灵活的八残基环通过Cys181附着到膜上，使RHEB位于膜上方约13埃处。
在RAPTOR的WD40结构域中，疏水侧链Phe1296和Met1297（称为FM指）在冷冻电镜密度图中表现出膜相互作用。mTOR的N-HEAT结构域中的特定残基Lys471、Arg472和Lys474形成了一个碱性环，也与膜密切接触。整个活性mTORC1组装体显示出巨大的膜覆盖足迹，这是由于mTOR和RAPTOR亚基的膜接触位点以及较小的膜-RHEB间隙所致。
二聚体结构中的两个RAPTOR-膜接触位点相距230埃。为了同时容纳这两个接触位点，脂质体直径必须足够大以提供相对平坦的平台。 accordingly，研究人员推断较小直径的脂质体会导致mTORC1激酶活性降低。实验证明，平均直径为67-81纳米的脂质体与平均直径为355纳米的脂质体相比，mTORC1激酶活性降低了约65%，验证了结构预测。
通过对称扩展和颗粒减法，研究人员去除了RAPTOR-RAG-Ragulator亚基，并识别出mTOR-RHEB-MLST8亚复合物的两种不同构象。他们将这两种状态指定为中间状态和完全活性状态，最终分辨率分别为3.61埃和3.16埃。
通过基于RHEB结构对齐这些状态，研究人员展示了中间状态和完全活性状态之间的构象变化。完全活性状态的M-HEAT结构域比中间状态更靠近N-HEAT结构域，平均距离约5埃。与中间状态相比，完全活性状态的FAT和激酶结构域向RHEB移动了约5-7埃，导致MLST8亚基更多地朝向RHEB。
可溶性mTORC1-RHEB结构在基于RHEB亚基叠加时，处于中间状态和完全活性状态的构象路径之间。mTOR-RHEB相互作用在中间状态和完全活性状态中基本保持，但mTOR FAT结构域的Met1255和Lys1256在中间状态是无序的，而在活性状态中与RHEB结合。
在mTOR中间状态，RHEB开关I区的Tyr35翻转到另一侧并与核苷酸分离，而在mTOR完全活性状态，RHEB的开关I区采用RHEB-GTP结合状态的典型构象。有趣的是，RHEBY35N突变与癌症相关，并且RHEBY35N的表达会过度激活mTORC1。
本研究解决了一个长期存在的难题：为什么对细胞中mTORC1激活至关重要的RHEB-GTP在溶液中是如此低亲和力的激活剂。研究发现生理浓度的脂质体、膜锚定的Ragulator和活性RAG二聚体能够在生化重组中有效激活mTORC1。虽然膜锚定降低维度的机制可能是一个贡献因素，但研究人员通过冷冻电镜结构测定更深入地探究了机制。
通过对中间状态和完全活性状态的原子级详细分析，研究人员绘制了一条由膜本身介导的激活途径。他们发现mTORC1的mTOR和RAPTOR亚基直接与膜接触。RAPTOR和mTOR残基之间超过230埃的膜接触促进了mTOR的N-HEAT、M-HEAT、FAT和激酶结构域的大规模构象重排。这些大规模变化反过来重新定向激酶结构域的N叶和C叶，以精细调节激酶活性位点达到催化最佳几何结构。
研究还意外地发现了MLST8上第二个以前未知的RAG-Ragulator结合位点。MLST8亚基是mTORC1和mTORC2共有的，但mTORC2中SIN1的额外存在阻断了这个以前未知的RAG-Ragulator位点，这与已知的mTORC2不与RAGs相互作用一致。这个以前未知的RAG-Ragulator位点与mTORC1中MLST8上的40 kDa脯氨酸丰富AKT底物（PRAS40）结合位点重叠。
从结构数据来看，RAG GTP酶二聚体通过Ragulator复合物锚定在溶酶体上。Ragulator通过其LAMTOR1亚基的脂化锚定，该亚基有一个约45个残基的N端无序区域，平均末端到末端长度约47埃，扩展长度约100埃。RAG-Ragulator与RAPTOR的结合使mTORC1的膜对接位点在与膜表面约40埃的范围内。这足够接近膜锚定的RHEB，其本身与膜的平均距离约15埃，扩展距离约40埃。
即使有RHEB，仍然不足以单独驱动完全的膜结合和激活。因此，溶酶体膜结合和酶激活是一个四步过程：首先由RAG-Ragulator驱动初始定位到膜的大约10纳米范围内；这使得RHEB能够在距离膜约1.5-4纳米处捕获mTORC1，此时发生RHEB结合状态特有的大构象变化；膜紧密对接首先由RAPTOR FM指驱动，该指在中间状态和完全活性状态都与膜接触；最后，mTOR-膜相互作用位点只在完全活性状态中观察到对接，表明这种相互作用参与了最终达到最高激活水平。
这项研究为mTORC1如何在溶酶体膜背景下整合生长因子和营养信号提供了令人满意的结构解释，不仅解决了一个长期存在的生物化学难题，而且为开发针对mTOR通路相关疾病（如癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病）的新型治疗策略提供了重要的结构基础。
生物通微信公众号
生物通 版权所有
