1 引言
衰老细胞表现出多种结构特征，其中一个非常显著的特征是核仁数量的减少和尺寸的增大。核仁是无膜细胞器，负责核糖体生物发生并调控细胞周期、代谢和凋亡等关键细胞过程。虽然增殖细胞通常有多个小核仁，但触发衰老的细胞则有一个显著的、增大的核仁，这被称为衰老相关核仁表型（SANP）。核仁尺寸的增加也是时序性衰老的标志。核仁越来越被认为是生物分子凝聚体，是相分离的结果，因此有人提出衰老和衰老中核仁数量快速减少和尺寸增大是核仁液滴融合的结果。然而，核仁表型的调控机制及其在衰老中的下游后果仍知之甚少。
TIF-IA（RRN3）是RNA聚合酶I（PolI）复合体的一个组分，是rDNA转录的限速步骤，因为它将PolI募集到rDNA启动子。它也是复合体中报告转导环境信号到PolI转录机制的组分。营养饥饿和特定应激会改变TIF-IA磷酸化，减小核仁尺寸。相反，研究表明神经酰胺以及UV-C辐射和阿司匹林等应激会导致TIF-IA降解，从而引起核仁尺寸显著增大和数量减少。鉴于这种应激介导的核仁表型与SANP相似，本研究探讨了TIF-IA在衰老中调控核仁表型的作用。
2 方法
本研究使用了多种细胞系和小鼠模型。IMR90人原代成纤维细胞稳定表达4-羟基他莫昔芬诱导的HRasG12V 融合蛋白（ER:Ras）或阴性对照载体（ER:Stop）。A549 WT和A549-ATG5-/- （ΔATG5）细胞、WT IMR90成纤维细胞和HCT116结肠癌细胞也被使用。小鼠模型包括诱导表达致癌性Ras（NrasG12V ）或失活突变体（NrasG12V/D38A ）的肝衰老模型，以及年轻和年老野生型（WT）和nfkb1-/- 小鼠的肠道衰老模型。
实验方法包括免疫组织化学/细胞化学、图像定量、质粒和siRNA转染、定量RT-PCR（qRT-PCR）、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、蛋白质印迹分析、免疫共沉淀和定量质谱分析TIF-IA相互作用组。统计分析使用GraphPad Prism软件进行。
3 结果
3.1 TIF-IA作为对癌基因和治疗诱导衰老的早期反应而积累
为了研究TIF-IA在SANP和衰老中的作用，首先检测了衰老诱导后该蛋白的水平。在癌基因诱导衰老（OIS）模型中，与预期相反，在OIS诱导后72小时观察到TIF-IA显著积累，特别是在细胞核和核仁中。动力学研究表明，这种积累在4-OHT暴露后24小时内就很明显，并且与核仁尺寸的时间依赖性增大和核仁数量的减少相平行。它先于细胞周期停滞和β-半乳糖苷酶活性增加等其他关键事件。
在使用DNA损伤剂依托泊苷的治疗诱导衰老（TIS）模型中，也观察到TIF-IA在细胞核和核仁中的早期积累。与OIS类似，TIF-IA积累与核仁融合密切相关，表现为核仁桥和核仁尺寸显著增大。
3.2 TIF-IA在体内衰老和衰老小鼠模型中积累
接下来在三种成熟的衰老和衰老小鼠模型中探索了TIF-IA的积累。在肝细胞中诱导OIS的模型中，表达致癌性NrasG12V 的小鼠肝脏中TIF-IA阳性细胞显著增加。在时序性和基因诱导衰老模型中，对年轻和年老WT及nfkb1-/- 小鼠肠道进行定量免疫组织化学显示，两组老年小鼠肠道核内TIF-IA强度均显著增加。在年轻小鼠中，WT和nfkb1-/- 之间肠道TIF-IA水平无显著差异，但在老年小鼠中，nfkb1-/- 组的TIF-IA显著高于WT。
这些发现表明，TIF-IA积累是跨多种体外和体内模型对衰老诱导和衰老的一致反应。
3.3 TIF-IA是衰老相关核仁表型所必需的
为了明确确立TIF-IA积累在SANP中的作用，使用了两种独立的siRNA在OIS启动期间和期间敲低该蛋白。发现在对照siRNA转染细胞中，OIS诱导后观察到的核仁面积增大和数量减少在TIF-IA耗竭时被显著减弱。与TIF-IA相反，耗竭同样对rDNA转录关键的PolI对RasG12V 诱导后的核仁面积没有显著影响。在TIS模型中也观察到类似结果。
为了进一步确定TIF-IA积累与SANP的联系，在IMR90成纤维细胞中过表达了该蛋白。发现与单独转染GFP相比，转染GFP-TIF-IA的细胞群体中核仁面积显著增加。此外，转染GFP-TIF-IA增强了RASG12V 诱导对核仁表型的影响。
增大的核仁通常与增强的核糖体生物发生相关。然而，与这一预期相反，47S前rRNA转录本的qRT-PCR分析显示，尽管在24-72小时ER:Ras细胞中明显存在TIF-IA积累和核仁增大，但与ER:Stop相比，4-OHT暴露后24-72小时47S rDNA转录显著降低。类似地，依托泊苷处理IMR90细胞导致TIF-IA积累和核仁增大，同时伴有47S转录减少。相反，依托泊苷处理HCT116细胞导致TIF-IA积累、核仁增大和47S转录增加。正如预期，siRNA耗竭TIF-IA和PolI都显著降低了IMR90细胞中的47S转录。然而，只有TIF-IA耗竭显著减弱了OIS诱导对核仁面积的影响。
这些数据表明TIF-IA积累是衰老中核仁表型的关键调节因子，并且提示这与核大小和47S转录无关。
3.4 TIF-IA不是衰老中细胞周期停滞所必需的，但对SASP因子的表达至关重要
衰老中的核仁变化与细胞周期停滞有关。因此，接下来使用BrdU掺入实验探讨了TIF-IA积累在这一终点中的作用。发现TIF-IA耗竭对RASG12V 诱导后观察到的初始过度增殖（与DNA损伤和完全衰老相关）或随后的细胞周期停滞没有影响。类似地，TIF-IA耗竭对衰老相关异染色质灶（SAHF）的形成没有影响。
衰老细胞分泌一组称为衰老相关分泌表型（SASP）的因子，这对旁分泌信号传导、免疫监视和稳定的衰老建立至关重要。NF-κB转录因子是SASP的关键调节因子，但对衰老的细胞周期效应是可有可无的。鉴于先前将TIF-IA与应激反应中的NF-κB联系起来，接下来探索了TIF-IA与衰老中SASP因子转录的关系。
时间进程研究显示，在OIS和TIS中，TIF-IA积累和核仁改变先于SASP因子转录。TIF-IA敲低也显著降低了多种细胞类型中OIS和TIS诱导后NF-κB靶基因和SASP因子的转录。与对SASP的影响一致，TIF-IA耗竭损害了衰老的建立，表现为细胞形态改变和β-半乳糖苷酶活性降低。相反，GFP-TIF-IA过表达增强了SASP基因转录 compared to GFP对照。此外，来自过表达GFP-TIF-IA细胞的条件培养基足以在初始HCT116细胞中诱导衰老，这表明TIF-IA蛋白积累后分泌了功能性SASP因子。
这些数据表明，TIF-IA在细胞核和核仁中的积累是SANP、SASP和衰老诱导中的一个早期且关键的事件。
3.5 在增殖细胞中TIF-IA与自噬受体p62结合
为了进一步理解TIF-IA在SANP和SASP中的作用，使用免疫共沉淀和定量质谱分析来鉴定新的TIF-IA相互作用蛋白，这些蛋白可能是此功能的效应器。选择依托泊苷处理后8小时的时间点，因为此时TIF-IA积累和增大的核仁已明显，但NF-κB尚未激活。TIF-IA相互作用蛋白组研究中最重要的蛋白之一是自噬货物受体SQSTM1（p62）。
免疫细胞化学证明TIF-IA与p62在增殖的野生型A549和IMR90细胞的离散细胞质斑点中共定位，并在耗竭自噬组分ATG5的A549细胞（ΔATG5）的大细胞质复合物中共定位。免疫共沉淀后的蛋白质印迹分析证实TIF-IA与A549细胞中的p62相互作用，并且这种相互作用通过ATG5的缺失而增强。相互作用的进一步图谱显示，野生型p62与TIF-IA的天然形式和高分子量（HMW）形式结合。删除p62 PB1结构域（负责同源二聚化和PKCα结合）后，与两种形式的结合都丧失，而删除泛素结合域（UBA）后，与HMW TIF-IA的结合丧失。基于这些数据，推测p62通过靶向该蛋白的泛素化形式进行降解来调节TIF-IA的基础水平。与这一建议一致，siRNA耗竭p62导致TIF-IA蛋白水平显著增加。
3.6 p62-TIF-IA结合在衰老中丢失，依赖于DNA损伤反应激酶ATM
接下来探索了衰老诱导对TIF-IA-p62相互作用的影响。免疫共沉淀后的免疫印迹分析显示，响应TIS，p62-TIF-IA结合显著减少。在OIS诱导后也观察到类似结果。免疫印迹定量显示，依托泊苷暴露后p62水平下降；然而，p62-TIF-IA结合的减少更为显著。这表明结合减少不仅仅是p62降解的结果，而是衰老诱导后特定通路可能破坏了这种相互作用。
DNA损伤是OIS和TIS的共同特征，也是衰老和衰老的关键贡献者。TIF-IA耗竭不影响OIS过度增殖阶段（在此期间发生DNA损伤）或与DNA损伤相关的SAHF形成。因此，假设p62-TIF-IA相互作用在DNA损伤下游丢失，导致TIF-IA积累。
共济失调毛细血管扩张突变激酶（ATM）是一种DNA损伤反应（DDR）激酶，在OIS和TIS的早期阶段被激活，并在驱动SASP、衰老和衰老中发挥特别重要的作用。因此，探讨了该激酶在TIF-IA-p62相互作用中的作用。免疫印迹和免疫共沉淀实验证明，使用ATM抑制剂KU55933（ATMi）抑制ATM活性导致TIF-IA蛋白显著减少和TIF-IA-p62结合增加。此外，在抑制剂存在下，TIF-IA-p62共定位斑点增加。
蛋白磷酸酶2A（PP2A）使TIF-IA的丝氨酸44去磷酸化，是ATM激酶的直接靶标，其活性在ATM介导的磷酸化后受到抑制。先前证明，当细胞暴露于PP2A抑制剂冈田酸时，TIF-IA会积累。还证明将TIF-IA的S44突变为磷酸模拟天冬氨酸（S44D）完全阻断了应激诱导的该蛋白降解。基于这些数据，认为S44去磷酸化是TIF-IA与p62结合所必需的，并且通过靶向PP2A，ATM阻断了这种去磷酸化。确实，免疫共沉淀实验证明，不能被去磷酸化的TIF-IA S44D突变体无法结合p62。进一步的缺失研究揭示，TIF-IA的氨基酸残基94-204足以用于p62相互作用。
基于上述和先前数据，提出了一个模型：在增殖细胞中，TIF-IA通过其与p62的结合被靶向降解。然而，在衰老诱导的早期阶段，ATM介导的PP2A抑制导致S44磷酸化的TIF-IA积累，p62结合丢失，蛋白质易位到细胞核/核仁，从而引起SANP和SASP。支持这一模型，发现在TIS中使用ATMi阻断TIF-IA积累显著减弱了响应依托泊苷的核仁增大。
3.7 TIF-IA积累导致活性氧（ROS）增加
线粒体核糖体功能受损会导致ROS生成，ROS在SASP中起关键作用，并模拟衰老诱导对核仁形态的影响。鉴于TIF-IA相互作用组富含线粒体核糖体蛋白并包括氧化应激的关键调节因子KEAP-1，认为TIF-IA积累可能通过引起氧化应激起作用。确实，CellRox深红实验表明，与单独表达GFP相比，GFP-TIF-IA的表达引起ROS显著增加。此外，在ROS清除剂NAC（N-乙酰-l-半胱氨酸）存在下，GFP-TIF-IA表达后观察到的IL-8转录增加被消除。这些数据为TIF-IA积累如何引起SASP和SANP提供了有趣的机制见解。
4 讨论
本研究的新观察是TIF-IA在衰老和衰老组织中积累，这种积累受ATM激活下游的p62调控，并且TIF-IA积累与衰老相关核仁表型（SANP）、衰老相关分泌表型（SASP）和稳定的衰老有因果关系。
TIF-IA在衰老中导致核仁数量减少和尺寸增大的机制仍不清楚。传统上，核仁尺寸增大被认为是rDNA转录增加的直接结果。然而，数据表明TIF-IA改变核仁形态与对rDNA转录的影响无关。在所有测试模型中，TIF-IA积累与核仁数量减少和尺寸增大有因果关系；然而，这些变化与47S rDNA转录没有关系。更近的数据表明，衰老中的核仁重塑可能是核仁液滴快速融合的结果，而不是核糖体生物发生增加。这样的融合事件被报告为降低或最小化影响47S转录。与核仁融合和rDNA转录之间的这种脱节一致，我们和其他人已经显示，响应特定应激条件，核仁数量减少伴随着尺寸增大，这与rDNA转录减少相关。这里敲低了PolI，它减少了47S转录但对核仁尺寸没有影响。这些数据支持一个模型，即TIF-IA在衰老中促进核仁融合，独立于其在核糖体生物发生中的典型作用。
研究表明TIF-IA过表达增加ROS水平，这可能有助于这些核仁变化。其他报道的调节核仁数量和尺寸的机制包括染色质动力学的调节、核膜LINC复合物的耗竭和rDNA损伤。有趣的是，最近证明了响应细胞外粘附线索变化的核仁融合。这与我们的研究特别相关，因为我们在依托泊苷处理后发现特异性与TIF-IA相互作用的19种蛋白质中的两种，KRT77和VASP，参与来自细胞外基质（ECM）的信号传导。这些数据提示ECM、TIF-IA、ROS和核仁融合之间可能存在联系，值得进一步研究。
氧化应激是衰老的一个标志，不仅与核仁结构变化有关，而且与SASP有关。与ROS在TIF-IA诱导的SASP中的因果作用一致，在ROS清除剂NAC存在下，TIF-IA过表达后观察到的IL-8转录增加被消除。TIF-IA升高ROS的机制，以及这如何引起SASP，仍有待确定。有研究表明，衰老诱导后，线粒体ROS可以激活JNK，导致染色质泄漏和随后激活驱动SASP的cGAS–STING–NF-κB轴。了解TIF-IA是否在JNK上游的这一通路内起作用，或者其对核仁结构的影响是否间接促进染色质释放和NF-κB激活，现在是优先事项。阐明这一机制可能发现抑制SASP和减轻年龄相关病理的新策略。
先前证明应激诱导的TIF-IA降解导致核仁数量减少、尺寸增大、NF-κB通路激活和凋亡。本文显示TIF-IA积累驱动SANP和SASP的数据似乎与这些发现相矛盾。然而，由于这两种情况都涉及细胞质TIF-IA的丢失，无论是通过核转位还是降解，可能是这种丢失触发到NF-κB和核仁的下游信号传导。或者，TIF-IA可能起“金发姑娘蛋白”的作用，即其积累和耗竭都破坏相似的信号网络。无论TIF-IA发挥其作用的下游机制如何，我们的数据共同提供了令人信服的证据，表明TIF-IA蛋白稳定性是细胞稳态的关键决定因素。
在本研究中，确定了p62在调节这种稳定性中的新作用。数据表明p62结合TIF-IA的泛素化形式，并且S44去磷酸化是这种相互作用所必需的。先前的研究表明，S44去磷酸化也是应激介导的TIF-IA降解所必需的。这提示一个模型，其中应激或衰老信号通过改变S44的磷酸化状态，从而改变p62结合和自噬降解来调节TIF-IA周转。先前的研究表明TIF-IA稳定性受MDM2介导的泛素化调节。MDM2是促进p62–TIF-IA结合，还是并行作用以调节不同的泛素连接，仍有待确定。阐明协调TIF-IA泛素化、磷酸化和p62募集的
打赏
