引言
药用植物活性成分的合成与积累具有器官、组织及细胞类型特异性，这种空间异质性对药用植物开发利用至关重要。穿心莲作为传统药用植物，其核心活性成分穿心莲内酯类二萜内酯（包括穿心莲内酯AD、脱水穿心莲内酯DDAD、14-脱氧穿心莲内酯14-DAD及新穿心莲内酯NAD）的精细分布与合成调控机制尚不明确。本研究通过整合质谱成像（MSI）与单细胞转录组（scRNA-seq）技术，首次在穿心莲中构建了药用成分多维空间分布与生物合成路径解析体系。
穿心莲内酯含量在叶片和茎表皮中更高
通过LC-QQQ-MS/MS定量分析发现，穿心莲内酯类成分在叶片中的含量（102.12 mg/g鲜重）显著高于茎部（9.98 mg/g），且茎部外周区域含量较内部高185倍。穿心莲内酯和14-脱氧穿心莲内酯在叶片中占主导，而茎部以穿心莲内酯和新穿心莲内酯为主，表明该类成分具有明显的组织特异性积累特征。
DESI-MSI在穿心莲中的最优实验条件
研究系统优化了DESI-MSI参数，确立甲醇/水/甲酸（90:10:0.01%）为流动相，流速2.0 μL/min，毛细管电压0.6 kV，采样锥电压45 V，氮气压力0.07 MPa，像素分辨率150×150 μm。该条件在保证离子化效率的同时，实现了穿心莲内酯类成分的高分辨率空间成像。
穿心莲内酯主要富集于叶片非叶脉组织及茎部外围
MSI空间映射显示，穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和14-脱氧穿心莲内酯在茎横切面皮层区域特异性富集，在叶片中则集中于非叶脉区域。多组织整合成像证实代谢物积累梯度为叶片＞茎外周，与LC-QQQ-MS/MS定量结果高度一致，验证了空间代谢组学工作流的可靠性。
ApCPS2特异性表达于叶肉细胞
通过叶片原生质体分离获得8303个高质量单细胞，转录组聚类鉴定出9个细胞亚群，注释为表皮细胞、叶肉细胞、韧皮部细胞和保卫细胞四大类。关键合成酶基因表达分析显示，上游萜类合酶ApCPS2在叶肉细胞簇（簇4/8/2）中特异性高表达，而下游P450酶（ApCYP72A399和ApCYP72AF1）呈广谱表达。双荧光素酶报告实验证实光响应转录因子ApHY5和ApPIF1可激活ApCPS2启动子（表达量分别提升15.80倍和7.69倍），形成叶肉细胞特异的转录调控模块。GO与KEGG富集分析表明，叶肉细胞簇（簇4/7/8）协同调控光合作用与萜类骨架合成通路，通过NADPH/ATP共享机制形成代谢互作网络。
光调控促进穿心莲内酯合成
叶片遮光实验发现，光照处理7天后叶片出现深褐色表型，遮光区域保持绿色。光化学效率（Fv/Fm）在0–24小时内下降后逐渐恢复，表明光损伤修复机制激活。LC-QQQ-MS/MS定量显示光照组穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量分别提升2.1倍、4.0倍、2.3倍和1.5倍（总量提升2.11倍）。DESI-MSI进一步验证光照叶肉区域内酯信号增强，证实光信号通过激活叶肉细胞代谢通路促进穿心莲内酯合成。
讨论与展望
本研究建立的MSI与scRNA-seq整合框架，揭示了穿心莲内酯在叶肉细胞中的光调控合成机制，为药用植物空间代谢研究提供了新策略。未来可通过多组学联用拓展代谢物覆盖范围，利用ApCPS2叶肉特异性表达系统开展代谢工程，并优化光照栽培条件提升活性成分产量。该技术体系可推广至其他药用植物次生代谢研究，推动中药现代化与产业化发展。
