ABSTRACT
猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retroviruses, PERVs）是存在于家猪（Sus scrofa）种系中的逆转录病毒序列，包括PERV-A、-B、-C三种亚型。其中PERV-A和-B可感染人类细胞，而PERV-C仅感染猪细胞。尽管多数PERV原病毒插入存在缺陷，但体外培养中已观察到具有增强复制能力的PERV-A/C重组体。筛选PERV-C阴性猪可有效阻断此类重组事件，提升异种移植安全性。
1 引言
全球器官移植需求与供体短缺的矛盾日益突出，猪因其生理相似性成为理想的异种移植供体。然而PERVs作为整合于基因组的内源性病毒，无法通过常规病原清除手段消除。PERV-A/C重组体在自然猪群中检出率较高（如美国三个商业猪场中45/204例阳性），且表现出高于亲本病毒的复制能力。尽管CRISPR-Cas9等技术可实现PERVs全基因组敲除，但天然PERV-C阴性个体具有无脱靶效应、简化监管审批流程等优势，可作为基因编辑的理想受体。
2 材料与方法
研究对142头长白猪、杜洛克猪、大白猪及其杂交猪进行筛查，采用多达9对引物（如PCR1-PCR7）进行多重PCR检测。通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序验证扩增特异性，并对4头猪（1头PERV-C阳性、3头推定阴性）进行PacBio长读长全基因组测序（覆盖度12-18×）。利用MAFFT比对生成PERV-C特异性50 bp诊断序列，通过Klumpy软件在基因组组装和原始读长中搜索PERV-C特征序列。
3 结果
初步筛查使用Martina等[30]引物，在121头猪中检出33头（27.3%）推定PERV-C阴性。但采用多引物panel复核后发现，11/18头初筛阴性个体实为阳性，表明单对引物检测存在漏检风险。扩展筛查（8对引物）确认6头为真实阴性（图2）。长读长测序验证显示：阳性猪#710在13号染色体携带插入多态性的PERV-C位点（图3B），而3头阴性猪（#610、#1098、#892）均未检出PERV-C序列，其基因组中对应位点处于"前病毒状态"（图3C-D）。群体水平估计PERV-C真实阳性率为89.4%（95% CI: 82.7%-93.7%）。
4 讨论
多引物PCR策略可显著提高PERV-C检测灵敏度，其中PCR5和PCR6能补充PCR1/PCR4的漏检。测序发现非特异性扩增条带多源于缺陷型PERV-C类似序列或其它PERV亚型。基因组数据证实阴性个体#1098与其父本#497的遗传一致性，支持PERV-C阴性性状的可遗传性。建立PERV-C阴性种群既可降低基因编辑复杂度，也能作为未编辑受体用于胚胎移植计划。
5 结论
结合多重PCR与长读长测序的验证框架，为异种移植供体猪的生物安全评估提供了可靠方案。天然PERV-C阴性种质的鉴定与选育，为规避病毒重组风险提供了除基因编辑外的实用路径。
