ABSTRACT
为了维持对健康至关重要的蛋白质稳态，动物进化出复杂的保护机制以应对各种急性和慢性应激。然而，对这些蛋白质应激反应的协调，特别是其年龄依赖性变化，尚不清楚。HSF-1是蛋白质稳态的关键调节因子。我们的研究确定了蛋白酶体亚基PBS-7是其关键调节因子。在衰老的线虫中，PBS-7结合减少降低了蛋白酶体介导的HSF-1降解。HSF-1的增加通过上调热休克蛋白（HSPs）和自噬基因来增强对慢性应激（如累积的蛋白质聚集体）的反应。同时，上调的HSPs抑制了HSF-1在急性应激（如热休克）时的激活。我们的发现揭示了一种协调急性和慢性蛋白质应激反应的机制，并强调了衰老过程中优先保护 against 日益增加的蛋白质聚集体的适应性变化。
1 Results
1.1 The Activation of HSF-1 Upon Heat Shock Is Reduced in Aged Worms
秀丽隐杆线虫通常在20°C下培养。为了追踪衰老过程中耐热性的变化，我们检测了成年第1、4、8、11和14天的线虫在35°C热休克4小时后的恢复率以及在37°C下的存活率。与之前的报告一致，线虫对急性热应激的抵抗力随衰老而下降。针对hsf-1 的RNAi进一步损害了成年第11天线虫剩余的热应激抵抗力，证实了其在热休克反应中的作用。
为了监测HSF-1激活的变化，我们接下来检测了不同年龄线虫在热休克后hsp 基因的诱导情况。令人惊讶的是，所有被检测的hsp 基因在常规温度下培养的衰老线虫中表达均升高。相比之下，它们在热休克后的诱导在成年第11天的衰老线虫中显著降低。HSF-1形成称为核应激颗粒的亚核斑点以驱动hsps 表达。与我们观察到的hsps 表达相似，我们发现内源性GFP标记的HSF-1（以下简称HSF-1::GFP）在未热休克的衰老线虫皮下细胞中有更多的亚核斑点，并且这些斑点在热休克后的增加存在年龄依赖性减少。因此，HSF-1在衰老线虫中具有更高的基础活性，但对急性热应激的反应迟钝。
1.2 Proteosome-Mediated HSF-1 Degradation Decreases With Ageing
正如我们之前报道的，HSF-1::GFP的蛋白水平在衰老线虫中增加，这可能导致其基础活性升高。与升高的蛋白水平不同，hsf-1 的mRNA表达在衰老过程中保持不变。因此，HSF-1蛋白的年龄依赖性增加可能是由于翻译后调控。
我们随后检测了未携带受精卵的年轻成年线虫（成年第0天）和生殖后衰老线虫（成年第8天）中HSF-1::GFP的相互作用组。通过质谱分析，在HSF-1::GFP的免疫共沉淀物中检测到了已报道的HSF-1相互作用因子，验证了我们的相互作用组分析。GSEA分析显示，在年轻线虫特异的HSF-1相互作用组中，“蛋白酶体”相关蛋白富集。在HSF-1相互作用组中鉴定出的蛋白酶体组分中，PBS-7（蛋白酶体亚基，哺乳动物PSMB4的线虫直系同源物）显示出最高的亲和力。在HEK293T细胞中，GFP-HSF-1也与FLAG-PBS-7发生免疫共沉淀。为了检测体内PBS-7与HSF-1的相互作用，我们构建了一个在其天然启动子控制下表达PBS-7::mCherry的MosSCI插入转基因，并将其与表达HSF-1::GFP的品系杂交。与我们的质谱数据一致，PBS-7::mCherry在成年第1天的年轻线虫中与HSF-1::GFP存在明显的相互作用，而在成年第8天的衰老线虫中，与HSF-1::GFP相互作用的PBS-7水平降低。
对不同年龄线虫的qPCR显示pbs-7 存在年龄依赖性下降。类似地，之前的蛋白质组学分析发现PBS-7随年龄增长而减少。我们也发现PBS-7::mCherry的蛋白水平在衰老线虫中降低。因此，PBS-7表达的下调可能导致衰老线虫中PBS-7-HSF-1相互作用的减少。
HSF-1与PBS-7的相互作用表明它可能被泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解。确实，在年轻成年线虫中，从成年第1天到第4天通过RNAi抑制pbs-7 增加了HSF-1的蛋白水平。此外，从经pbs-7 RNAi处理的线虫中纯化的HSF-1显示出更强的泛素化水平。在年轻线虫中，用MG132抑制蛋白酶体以与pbs-7 RNAi类似的方式上调HSF-1，而pbs-7 RNAi在MG132处理的线虫中没有进一步增加HSF-1，证实PBS-7通过UPS诱导HSF-1降解。使用氯喹阻断自噬并未阻断pbs-7 RNAi诱导的HSF-1上调，表明PBS-7不通过自噬调节HSF-1。由于HSF-1::GFP与PBS-7::mCherry的相互作用在衰老线虫中减少，HSF-1的年龄依赖性增加可能是由于其蛋白酶体介导的降解减少。如果是这样，在衰老线虫中抑制pbs-7 应该对HSF-1水平影响很小，因为HSF-1-PBS-7相互作用已经减少。与这一推测一致，在衰老线虫中从成年第8天到第11天进行pbs-7 RNAi处理并未改变HSF-1水平。
1.3 The Reduced HSF-1 Degradation Improves Resistance to Protein Aggregates
在衰老过程中，线虫遭受由累积的蛋白质聚集体引起的慢性蛋白质应激。衰老线虫中HSF-1的增加可能适应这种慢性蛋白质应激。我们使用在肠道中表达多聚谷氨酰胺（polyQ）的线虫测试了这一假设。抑制pbs-7 （模拟年龄依赖性的PBS-7水平降低和UPS介导的HSF-1降解）显著降低了成年第5天线虫的polyQ表达和由此产生的聚集体。进一步抑制hsf-1 恢复了经pbs-7 RNAi处理的线虫中的polyQ表达和聚集体。我们进一步检测了在体壁肌肉中表达人Aβ (1-42)的线虫。类似地，pbs-7 RNAi减少了Aβ聚集体，而同时抑制pbs-7 和hsf-1 则没有。此外，抑制pbs-7 通过hsf-1 改善了Aβ疾病模型线虫的健康状况，通过瘫痪率衡量。因此，PBS-7的减少通过上调HSF-1促进蛋白质稳态。
HSF-1控制着对抗慢性蛋白质应激的多种途径。正如预期，在年轻成年线虫中进行pbs-7 RNAi诱导了多种hsps 和一系列自噬基因的转录。同时进行pbs-7 和hsf-1 的双重RNAi将这些基因的表达降低到与用luc2 RNAi处理的线虫相同的水平。我们进一步使用mCherry::GFP::LGG-1报告基因检测了经pbs-7 RNAi处理的线虫的自噬。与自噬基因的上调一致，抑制pbs-7 增加了体壁肌肉中的自噬体和自噬溶酶体。总之，通过UPS上调HSF-1通过增加自噬和伴侣蛋白保护线虫免受慢性蛋白质应激。
1.4 The Reduced HSF-1 Degradation Suppresses Heat Shock Responses
HSF-1在热休克时的激活需要从其结合的HSPs上解离。因此，衰老线虫中升高的HSPs 基础水平可能会在热应激时上调HSP-HSF-1相互作用，从而损害线虫的耐热性。与这一假设一致，我们的质谱数据在来自衰老线虫的HSF-1::GFP免疫共沉淀物中发现了7种特异性存在的HSPs。其中一种是HSP70（F44E5.4/F44E5.5），据报道可抑制HSF-1转录活性。F44E5.4 和F44E5.5 是彼此的重复基因，位于同一染色体上位置相近，并共享具有HSF-1结合位点的启动子区域。在本研究中，我们不区分这两个基因，统称为F44E5.4/5 。我们进一步发现HA-F44E5.4/5在HEK293T细胞中与GFP-HSF-1相互作用。
为了进一步验证这一假设，我们在年轻成年线虫中从成年第1天到第4天用pbs-7 RNAi处理，以模拟衰老线虫中HSF-1和hsps 水平的增加。正如我们所料，抑制pbs-7 损害了耐热性，降低了热休克后的恢复率和热应激下的存活率。一致地，在年轻线虫中用pbs-7 RNAi处理抑制了热休克后hsp 基因的诱导和细胞核中HSF-1::GFP颗粒的形成。
如果衰老线虫中升高的hsps 基础水平钝化了HSF-1在热休克时的激活，那么适当抑制hsp 应该能改善线虫的热应激抵抗力。我们随后在衰老线虫中从第10天到第11天用温和的F44E5.4/5 RNAi（约降低40%）处理，试图模拟其在年轻线虫中的水平。与我们的假设一致，在衰老线虫中轻度降低F44E5.4/5 改善了热休克后的恢复率和热应激下的存活。此外，在衰老线虫中抑制F44E5.4/5 也增加了热休克后HSF-1::GFP核应激颗粒的形成。为了确认改善的热应激反应是由于抑制了F44E5.4/5 的年龄依赖性增加，我们接下来在年轻线虫中使用相同的F44E5.4/5 RNAi处理。正如预期，在年轻线虫中抑制F44E5.4/5 不影响热应激抵抗力或HSF-1::GFP应激颗粒在细胞核中的形成。同时，针对另外两个hsps （C12C8.1 和hsp-90 ）的RNAi对衰老线虫的耐热性影响很小，表明并非所有hsps 都参与HSF-1的年龄依赖性调节。总之，蛋白酶体介导的HSF-1降解对于线虫抵抗急性热应激至关重要。
2 Discussion
HSF1是跨生物体蛋白质稳态的主要调节因子。虽然蛋白质代谢失衡是衰老的一个标志，但HSF1在衰老中的变化仍知之甚少。先前的一项研究强调了成年早期hsp 基因DNA甲基化的改变是线虫衰老过程中HSF-1活性的关键调节因子。
在本研究中，我们确定了UPS通路是HSF-1的另一个年龄依赖性调节因子，直接影响其蛋白水平。通过检查其在年轻和衰老线虫中的相互作用组，我们发现HSF-1与蛋白酶体组分（特别是PBS-7）的相互作用随年龄增长而下降，导致蛋白酶体介导的HSF-1降解减少。据报道，泛素化蛋白质组在线虫衰老过程中发生显著变化。因此，除了衰老过程中PBS-7的减少外，HSF-1泛素化的改变也可能导致其UPS介导的降解减少。
UPS介导的调节可能使HSF-1能够感知恶化的蛋白质稳态，并在衰老过程中作为一种适应性机制。UPS本身通过清除受损或错误折叠的蛋白质对维持蛋白质稳态至关重要，其失调是衰老过程中蛋白质稳态受损的主要因素。PBS-7-HSF-1相互作用可以作为衰老适应的检查点。在衰老动物中UPS功能减弱时，PBS-7-HSF-1相互作用受损，导致HSF-1上调以缓解被破坏的蛋白质稳态。由于我们在HSF-1相互作用组中也鉴定了其他蛋白酶体组分，这一检查点可能涉及HSF-1与更广泛范围的蛋白酶体蛋白的相互作用。此外，累积的受损蛋白质也可能有助于衰老过程中HSF-1的激活。与这一推测一致，我们观察到在未热休克的衰老野生型线虫中HSF-1蛋白上调、HSF-1核颗粒增加以及hsps 转录升高。一致地，在年轻疾病模型线虫中通过pbs-7 RNAi上调HSF-1减少了多聚谷氨酰胺和淀粉样蛋白-β聚集，降低了瘫痪率。
HSF-1在细胞核中形成应激颗粒，并驱动多种蛋白质稳态通路，包括诱导协助蛋白质折叠和错误折叠或变性蛋白质复性的hsp 分子伴侣，以及清除不需要蛋白质的自噬。与HSF-1的年龄依赖性增加一致，我们和其他人观察到衰老线虫中hsps 转录显著增加。此外，在年轻线虫中增加HSF-1也如我们推测的那样诱导了hsps 和自噬。这些发现表明，HSF-1的上调保护衰老线虫免受慢性蛋白质应激。
有趣的是，我们发现衰老线虫中hsps 基础水平的升高损害而不是增强了热休克反应。在热休克时，HSPs从HSF-1上解离，允许HSF-1激活其下游转录程序以进行热休克反应。在未受应激的衰老线虫中升高的hsps 基础水平可能会在热应激期间抑制HSPs从HSF-1上释放，从而降低耐热性。正如我们假设的，质谱分析显示HSF-1在衰老线虫中与HSPs有更强的相互作用。HSF-1活性的诱导在衰老线虫或HSF-1升高的年轻线虫中也显著减弱。一致地，在衰老线虫中轻度抑制hsp （例如F44E5.4/5 ）改善了HSF-1的激活。值得注意的是，在衰老线虫中抑制另外两个hsps （C12C8.1 和hsp-90 ）几乎不改变耐热性，表明并非所有hsps 都参与HSF-1的年龄依赖性调节。这些发现表明，UPS介导的调节精细地调整HSF-1以响应各种蛋白质应激。
在衰老过程中，蛋白质应激发生显著变化。年轻生物体主要受到急性应激源（如突然的温度变化）的挑战，这需要HSF1快速而强大的激活。相比之下，衰老的特征是错误折叠和聚集蛋白质的逐渐积累，引入了额外的慢性蛋白质毒性应激，成为老年动物面临的严峻挑战。蛋白质应激的这种年龄依赖性变化需要增加HSF1的基础激活以减轻持续的蛋白质毒性负担，尽管代价是减弱对热休克的反应。我们对HSF1活性向慢性应激转换的发现突出了适应性衰老的一个关键方面，即细胞机制进化以优先考虑长期维持而非即时应激反应。
3 Methods
简要概述研究中使用的线虫品系、培养条件、质粒构建、转基因、RNA干扰、热抵抗力测定、显微镜检查、应激颗粒分析、蛋白质聚集体分析、自噬分析、瘫痪分析、定量RT-PCR、细胞培养和转染、免疫印迹、免疫沉淀和质谱分析以及统计方法。所有实验均按照标准方案进行，并进行了多次生物学重复以确保结果的可靠性。
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