呼吸缺陷细胞需要丙酮酸羧化酶（PC）以抑制天冬酰胺营养缺陷

线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）突变会损害电子传递链（electron transport chain, ETC）活性和氧化磷酸化，但其表型后果随异质性水平而变化。增加mtDNA异质性是否会产生呼吸正常细胞所不具有的代谢依赖性，此前仍不清楚。研究人员在此证明，丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase, PC）的低表达在具有高mtDNA异质性的呼吸受损细胞中造成天冬酰胺依赖性。在携带相似mtDNA缺失的同基因细胞中，呼吸作用随异质性增加呈线性下降，而氧化还原失衡仅在异质性高于50%时出现。当异质性高于70%时，出现整合应激反应（integrated stress response, ISR）相关的翻译缺陷，该缺陷可通过外源天冬酰胺或PC过表达逆转。天冬酰胺依赖性在呼吸缺陷细胞中与PC表达呈负相关。与此模式一致，携带高异质性复合物I突变且PC水平低的患者来源甲状腺肿瘤细胞表现出天冬酰胺营养缺陷，并对L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）敏感。总之，这些发现证明了线粒体PC在呼吸活性受损条件下参与细胞天冬酰胺合成的作用。

论文解读

线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）突变会损害电子传递链（electron transport chain, ETC）活性和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS），但其表型后果随异质性水平而异。在肿瘤中，高异质性甚至近同质性的mtDNA突变富集于特定类型，然而增加mtDNA异质性是否会创造呼吸正常细胞所没有的代谢依赖，尚不清楚。研究人员利用携带3.5 kb mtDNA缺失（mtDNAΔScaI）的非转化人视网膜色素上皮（RPE）同基因细胞系，系统研究了从3%到99%异质性梯度克隆的代谢变化，发现低丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase, PC）表达的呼吸缺陷细胞出现天冬酰胺营养缺陷（asparagine auxotrophy），而PC过表达可恢复天冬酰胺合成。患者来源的高异质性复合物I突变甲状腺肿瘤细胞对L-天冬酰胺酶敏感。该研究揭示了线粒体PC在呼吸受损时支持天冬酰胺合成的关键作用，为L-天冬酰胺酶治疗高异质性mtDNA突变肿瘤提供依据。论文发表在《Nature Metabolism》。

关键技术方法方面，研究人员通过微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）定量mtDNA异质性；Seahorse分析仪测量耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）；酶学方法测定NADH/NAD⁺比值；使用[U-¹³C]葡萄糖和[U-¹³C]谷氨酰胺示踪，结合气相或液相色谱-质谱分析代谢物和同位素标记；采用蛋白质组学与基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；运用CRISPR-Cas9基因敲除、免疫印迹和异种移植瘤模型。细胞来源包括RPE mtDNAΔScaI克隆、DddA来源胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）编辑的ND4点突变克隆（mtDNA^DdCBE-ND4）、核编码ETC组分敲除细胞、143B骨肉瘤及其细胞色素b（cytB）突变细胞、患者来源甲状腺肿瘤NCI-237（MT-ND5突变，异质性90%）、正常甲状腺Nthy-ori 3-1、甲状腺癌TPC1、结直肠癌DLD1及乳腺癌MDA-MB-231等。

研究结果如下。

**mtDNA异质性细胞表现出缺陷的氧化代谢**：通过ddPCR确认异质性水平后，Seahorse分析显示基础与最大OCR随异质性升高近线性下降；85%以上异质性克隆出现NADH/NAD⁺比值升高、ETC复合物I-IV蛋白下降及增殖受损。外源丙酮酸或α-酮丁酸（alpha-ketobutyrate, AKB）可降低NADH/NAD⁺并促进高异质性细胞增殖。表达来自Lactobacillus brevis的水形成NADH氧化酶（LbNOX）仅轻微促进增殖，提示氧化还原失衡并非唯一限制因素。

**氨基酸补充增强高异质性细胞的增殖**：在含丙酮酸和尿苷的培养基中，非必需氨基酸（non-essential amino acids, NEAA）仅增强90%以上异质性克隆的增殖；逐一筛选发现仅天冬酰胺有效。同位素示踪显示高异质性细胞中谷氨酰胺来源的天冬酰胺合成显著减少。

**天冬酰胺限制激活整合应激反应（integrated stress response, ISR）并抑制蛋白质合成**：蛋白质组学显示无外源天冬酰胺时ATF4通路富集，ATF4蛋白升高，GCN2激酶磷酸化；天冬酰胺可抑制GCN2磷酸化并降低ATF4。敲除GCN2编码基因EIF2AK4可消除ATF4激活，但细胞仍依赖天冬酰胺增殖。

**高异质性细胞可利用PC维持天冬酰胺合成**：[U-¹³C]葡萄糖示踪显示99%异质性RPE细胞中葡萄糖来源天冬酰胺(m⁺³)远低于143B cytB细胞；PC异位表达可提高天冬氨酸和天冬酰胺(m⁺³)标记比例，升高总天冬酰胺水平，降低ATF4并恢复增殖。

**内源性PC是143B cytB细胞在无外源天冬酰胺时增殖所必需**：143B cytB细胞高表达PC，外源天冬酰胺不影响其增殖；敲除PC后，葡萄糖来源天冬氨酸和天冬酰胺(m⁺³)减少，ATF4激活，增殖下降，而天冬酰胺或PC回补可恢复。

**携带mtDNA点突变的细胞表现出异质性依赖的天冬酰胺营养缺陷**：RPE ND4点突变克隆在异质性≥72%时出现呼吸缺陷，天冬酰胺促进增殖；PC表达提高天冬酰胺并抑制ATF4。核编码ETC组分UQCRC2或COX₄I1敲除的RPE细胞也依赖天冬酰胺，而高PC的143B细胞需敲除PC才表现依赖。

**组织特异性PC水平调节呼吸抑制下的天冬酰胺依赖性**：多种上皮来源细胞PC表达低于143B，呼吸抑制时天冬酰胺促进其增殖；高PC的MDA-MB-231细胞敲除PC后，呼吸抑制条件下增殖受损并可被天冬酰胺恢复。

**呼吸缺陷的甲状腺癌细胞表现出天冬酰胺营养缺陷**：NCI-237细胞呼吸极低、NADH/NAD⁺升高、PC低表达，天冬酰胺促进增殖并抑制ATF4报告基因活性。PC表达使葡萄糖+丙酮酸来源的天冬氨酸(m⁺³)增加3.4倍，天冬酰胺(m⁺³)增加4.3倍，并促进细胞生长。

**天冬酰胺酶在体外和体内减少呼吸缺陷肿瘤生长**：L-天冬酰胺酶处理在体外清除天冬酰胺，逆转其促增殖和抑制ATF4的效应；在人类血浆样培养基（human plasma-like medium, HPLM）中显著抑制NCI-237增殖，且不影响谷氨酰胺水平。在NSG小鼠异种移植模型中，每日腹腔注射天冬酰胺酶（80 IU）显著降低肿瘤体积和终末肿瘤重量。

讨论部分指出，呼吸缺陷细胞能否产生足够天冬酰胺取决于内源PC表达。低PC细胞在mtDNA异质性超过85%时诱导ISR，天冬酰胺依赖在缺失模型、点突变模型及药理学或遗传学ETC抑制中均存在，说明三羧酸循环偶联的ETC受损是根本原因。天冬酰胺仅用于tRNA^Asn充电和蛋白质合成，不能转化为其他代谢物，因此未充电tRNA激活GCN2-eIF2α-ATF4通路。尽管ATF4上调天冬酰胺合成酶（ASNS），低PC细胞仍无法满足天冬酰胺需求。PC水平不因应激而诱导。线粒体天冬氨酸可能被导向核苷酸合成，影响胞浆天冬酰胺合成。研究结论为：这些发现证明线粒体PC在呼吸活性受损条件下对细胞天冬酰胺合成具有关键作用；高异质性mtDNA突变且PC低表达的肿瘤是天冬酰胺营养缺陷型，可能是L-天冬酰胺酶治疗的潜在新靶点。