背景：缺血性脑卒中发生于脑血流受阻时。快速恢复血供常诱发脑缺血再灌注损伤（CIRI）。骨髓间充质干细胞（BMSC）来源外泌体对CIRI展现出有前景的治疗潜力。深入探究其治疗机制对CIRI管理具有重要意义。方法：在小鼠中建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO）模型。通过氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理BV-2细胞建立体外缺血性脑卒中模型。从BMSCs中分离外泌体，经鼻内给药于小鼠或加入BV-2细胞。评估神经功能缺损、抓握与协调功能。检测细胞活力、凋亡、增殖与迁移。通过免疫荧光与荧光原位杂交联合染色检测KLF3-AS1的定位。评估细胞内Ca2+与三磷酸腺苷水平、线粒体活性氧与膜电位。结果：KLF3-AS1增强BMSC活力、增殖与迁移，伴随其启动子处表观遗传重编程，特征为H3K27乙酰化（H3K27Ac）增加与H3K27三甲基化（H3K27Me3）减少。富含KLF3-AS1的BMSC来源外泌体在脑缺血体内与体外模型中均显示治疗效力。在MCAO诱导小鼠中，这些外泌体减轻神经功能缺损并促使微胶质细胞极化从促炎M1样向抗炎M2样表型转变。在OGD/R处理的BV-2微胶质细胞中观察到类似效应，富含KLF3-AS1的外泌体减轻氧化应激与线粒体功能障碍，同时上调沉默信息调节因子3（SIRT3）表达。机制上，KLF3-AS1促进ETS变异转录因子4（ETV4）核转位以激活微胶质细胞中SIRT3转录，而抑制SIRT3可消除外泌体KLF3-AS1的神经保护作用。结论：BMSC来源外泌体递送KLF3-AS1通过维持微胶质细胞线粒体功能并抑制炎症极化改善CIRI，突显KLF3-AS1作为关键表观遗传调控因子及通过ETV4/SIRT3轴介导外泌体治疗的CIRI治疗剂。
研究背景：缺血性脑卒中约占所有卒中的85%，由脑动脉内血栓栓塞或血栓形成导致脑血流突然闭塞引起，是全球死亡和残疾的主要原因。主要治疗策略为快速恢复脑血流以挽救缺血半暗带并防止继发性神经元损伤。然而，血流恢复本身可通过钙超载、氧化应激、血脑屏障破坏、凋亡和铁死亡等多种机制引起严重神经损伤，即脑缺血再灌注损伤（CIRI）。CIRI发病机制复杂，阻碍了有效治疗方法的开发。骨髓间充质干细胞（BMSC）来源外泌体对CIRI展现出有前景的治疗潜力，可将微胶质细胞极化从促炎M1向抗炎M2表型转变。越来越多证据表明长链非编码RNA（lncRNA）是BMSC来源外泌体的关键货物成分。BMSC来源外泌体lncRNA KLF3-AS1可通过ETV4/SIRT1轴促进自噬或通过miR-206/USP22轴稳定SIRT1来改善CIRI。然而，BMSCs中KLF3-AS1启动子的组蛋白乙酰化与甲基化修饰尚未阐明，KLF3-AS1是否通过SIRT3调控微胶质细胞线粒体功能与炎症极化仍未知。本研究旨在探究：（1）KLF3-AS1启动子的组蛋白乙酰化与甲基化修饰是否调控其在BMSCs中的表达；（2）外泌体KLF3-AS1是否通过ETV4/SIRT3轴维持微胶质细胞线粒体功能并调节炎症极化来保护CIRI。研究发现KLF3-AS1启动子的组蛋白乙酰化与去甲基化协同上调BMSC来源外泌体中KLF3-AS1表达，增强BMSC迁移与功能；富含KLF3-AS1的外泌体通过促进ETV4核转位并激活SIRT3表达，改善线粒体功能障碍并促进微胶质细胞向抗炎M2表型极化，最终对CIRI发挥保护作用。
关键技术方法：研究采用人BMSCs（ATCC PCS-500-012）及从8周龄雄性C57BL/6小鼠胫骨和股骨分离的原代小鼠BMSCs；建立小鼠MCAO模型及BV-2微胶质细胞OGD/R模型；从BMSCs分离外泌体并经鼻内给药或加入BV-2细胞；临床样本来自湖南省人民医院（湖南师范大学附属第一医院）的CIRI患者与健康对照，纳入年龄≥18岁、确诊急性缺血性脑卒中、24小时内接受再灌注治疗且有再灌注损伤证据者，排除既往卒中、颅内出血、严重器官疾病、恶性肿瘤、自身免疫疾病或妊娠者，于再灌注后24小时内采集血浆；采用免疫荧光与荧光原位杂交联合染色、染色质免疫沉淀（ChIP）、RNA pull-down、RNA免疫沉淀（RIP）、双荧光素酶报告基因 assay、qRT-PCR、Western blotting及TEM等技术。
研究结果：
3.1 KLF3-AS1促进BMSC活力、增殖与迁移：通过LncATLAS数据库分析及RNA-FISH证实KLF3-AS1主要定位于BMSC核内；过表达KLF3-AS1后，MTT、EdU掺入、TUNEL、伤口愈合与Transwell实验表明其增强BMSC活力与增殖、抑制凋亡并促进迁移。
3.2 BMSCs中KLF3-AS1启动子H3K27Ac增加与H3K27Me3减少与KAT6A和KDM4A相关：ChIP-qPCR显示KLF3-AS1启动子区H3K27ac显著富集而H3K27me3富集较低；p300/CBP抑制剂C646降低KLF3-AS1表达；ChIP筛选发现KAT6A和KDM4A为主要结合于KLF3-AS1启动子的组蛋白赖氨酸乙酰转移酶和去甲基化酶；敲低KAT6A降低KLF3-AS1表达并损害H3K27Ac富集，过表达KDM4A降低KLF3-AS1表达并减少H3K27Me3富集，表明KAT6A与KDM4A分别介导KLF3-AS1启动子H3K27Ac增加与H3K27Me3减少。
3.3 BMSC来源外泌体KLF3-AS1改善MCAO小鼠神经损伤：外泌体呈典型杯状形态、表达CD63/CD81/TSG101而不表达Calnexin、粒径约120 nm；ExoMock与ExoKLF3-AS1降低mNSS评分与足误率、延长转棒时间、减少梗死面积与脑含水量、减轻NeuN阳性神经元凋亡，且ExoKLF3-AS1效果更强。
3.4 富含KLF3-AS1的BMSC外泌体促使MCAO小鼠微胶质细胞向M2样表型转变：FISH-IF显示KLF3-AS1与Iba1共定位而不与NeuN或GFAP共定位；PKH26/DiI标记证实外泌体被微胶质细胞内化；ExoMock减少CD16/32
+Iba1
+ M1样细胞、增加CD206
+Iba1
+ M2样细胞，降低M1标志物CD86、TNF-α、IL-1β、IL-6表达，促进M2标志物Arg-1、IL-10、TGF-β表达，ExoKLF3-AS1进一步增强这些效应。
3.5 富含KLF3-AS1的BMSC外泌体促使OGD/R处理BV-2细胞向M2样表型转变：ExoKLF3-AS1组BV-2细胞活力最高；ExoMock抑制OGD/R诱导的CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6表达并增强Arg-1、IL-10、TGF-β表达，ExoKLF3-AS1进一步强化；Iba1/iNOS与Iba1/Arg-1共染证实上述极化转变。
3.6 BMSC来源富含KLF3-AS1外泌体改善OGD/R诱导的氧化应激与线粒体功能障碍并上调微胶质细胞SIRT3：TEM显示ExoKLF3-AS1减轻线粒体肿胀、恢复线粒体长度与嵴数量、增加线粒体自噬体包裹的线粒体比例；MitoTracker显示线粒体长度恢复；F03与MitoSox Red显示细胞内Ca
2+与线粒体ROS降低；JC-1显示膜电位恢复；ATP水平回升；SIRT3在OGD/R后下调而被ExoMock与ExoKLF3-AS1逐步上调，MCAO脑内Iba1与SIRT3双阳性细胞亦呈相同趋势。
3.7 KLF3-AS1通过促进微胶质细胞ETV4核转位激活SIRT3表达：过表达KLF3-AS1不影响ETV4总表达但促进其核转位；RNA pull-down与RIP证实KLF3-AS1与ETV4直接物理互作；JASPAR预测及双荧光素酶报告基因证实ETV4结合SIRT3启动子并激活转录；ChIP证实KLF3-AS1促进ETV4在SIRT3启动子的富集；挽救实验表明敲低ETV4可消除KLF3-AS1对细胞活力、M1/M2标志物、极化与膜电位的调控作用及SIRT3上调。
3.8 抑制SIRT3逆转外泌体KLF3-AS1对OGD/R处理微胶质细胞的保护作用：sh-SIRT3或SIRT3抑制剂3-TYP可消除KLF3-AS1对细胞活力的改善、M1标志物抑制与M2标志物促进、M1-to-M2极化、线粒体ROS减少、膜电位恢复与ATP水平恢复，证实SIRT3是KLF3-AS1保护作用的关键下游效应分子；CIRI患者血浆KLF3-AS1与SIRT3表达降低且呈正相关。
讨论部分总结：本研究证明KAT6A与KDM4A通过启动子处相反的组蛋白修饰双向调控KLF3-AS1转录——KAT6A促进组蛋白乙酰化而KDM4A介导去甲基化。富含KLF3-AS1的BMSC外泌体促进ETV4核转位，增强SIRT3转录，该KLF3-AS1/ETV4/SIRT3轴改善线粒体功能、促进微胶质细胞向抗炎M2表型极化，最终减轻CIRI。研究将KLF3-AS1/ETV4轴的作用从SIRT1介导的自噬拓展至SIRT3介导的线粒体调控，并首次提供KAT6A介导的组蛋白乙酰化与KDM4A介导的组蛋白去甲基化在BMSCs中表观遗传调控KLF3-AS1表达的证据。研究亦指出若干局限：KLF3-AS1促进ETV4核转位的精确分子机制尚未阐明；临床验证样本量小；未系统量化外泌体体内生物分布、递送效率与靶向特异性；M1/M2二分法简化了微胶质细胞复杂动态的激活状态；外泌体治疗的长期安全性、免疫原性、储存稳定性与GMP兼容生产有待评估。转化考虑方面，外泌体工程（表面修饰脑靶向配体与货物装载优化）、剂量与递送途径优化（鼻内给药为非侵入性途径且绕过血脑屏障）、安全性与稳定性表征以及标准化与规模化GMP生产仍是临床转化面临的挑战。
研究结论翻译：KLF3-AS1显著增强BMSC活力、增殖与迁移并抑制凋亡，BMSC来源富含KLF3-AS1的外泌体通过ETV4/SIRT3轴维持线粒体功能并抑制炎症性微胶质细胞极化，从而改善CIRI。本研究阐明了BMSC来源外泌体KLF3-AS1改善CIRI的机制，并确定了CIRI管理的新治疗靶点与无细胞策略。临床上，CIRI患者中KLF3-AS1与SIRT3的正相关验证了该轴的转化相关性，提示其失调参与人类缺血再灌注病理生理过程。本研究建立了超越既往KLF3-AS1在CIRI中报道的概念上新机制：既往研究证明BMSC来源外泌体KLF3-AS1通过ETV4/SIRT1介导的自噬或miR-206/USP22/SIRT1介导的蛋白稳定化保护CIRI，而本研究揭示了涉及SIRT3而非SIRT1的独特通路；此外，虽然近期报道ETV4通过YBX1/GPX4轴抑制神经元铁死亡，本研究揭示了ETV4通过SIRT3转录激活调控微胶质细胞线粒体功能与炎症极化的新作用；本研究还首次提供KAT6A介导的组蛋白乙酰化与KDM4A介导的组蛋白去甲基化在BMSCs中表观遗传调控KLF3-AS1表达的证据。
