靶向ACKR1+ 内皮细胞通过阻断单核细胞浸润/极化及内皮-间充质转化缓解肺纤维化

尽管微血管异常驱动特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF），但致病性内皮细胞（endothelial cell, EC）亚群及其特异性分子网络仍不清楚。研究人员通过整合单细胞（single-cell）转录组学（transcriptomics）和空间转录组学（spatial transcriptomics），鉴定出一个病理性扩增的ACKR1⁺ EC亚群，该亚群与肺功能下降相关，并在IPF中形成促纤维化的内皮-成纤维细胞生态位（niche）。在该生态位内，成纤维细胞来源的转化生长因子-β（transforming growth factor-beta, TGF-β）通过SMAD2轴上调内皮ACKR1转录。研究人员证明ACKR1⁺ EC通过两种截然不同的机制促进纤维化。在细胞水平上，互作组图谱（interactome mapping）显示ACKR1通过竞争性隔离内吞衔接蛋白（endocytic adaptor）NUMB驱动内皮-间充质转化（endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT），从而阻止NOTCH1的溶酶体降解并维持Notch信号过度激活。在微环境中，ACKR1⁺ EC通过CCL2转胞吞作用（transcytosis）介导单核细胞募集，并分泌胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein 7, IGFBP7），通过CD93/PI3K/AKT信号轴极化促纤维化的M2巨噬细胞。内皮特异性敲除（endothelial-specific deletion）Ackr1可抵抗博来霉素（bleomycin）诱导的肺纤维化。通过基于结构的虚拟筛选（structure-based virtual screening），研究人员鉴定出1F-Fructofuranosylnystose为直接ACKR1抑制剂。药理学阻断（pharmacological blockade）实验显示，1F-Fructofuranosylnystose可阻止EndMT和致病性巨噬细胞募集，在小鼠模型（murine models）、雪貂模型（ferret models）和人体精密肺切片（human precision-cut lung slices）中保留肺结构（lung architecture）和呼吸力学（respiratory mechanics）。这些发现确立了ACKR1⁺ EC在纤维化中的机制基础，并强调ACKR1抑制是IPF的一种靶向治疗策略。

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种以细胞外基质（extracellular matrix, ECM）进行性沉积和肺结构重塑为特征的慢性间质性肺病，相关论文发表于《Pharmacological Research》。尽管吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）等抗纤维化药物可减缓疾病进展，但无法阻断或逆转纤维化进程，患者诊断后中位生存期仅3至5年。因此，鉴定能够破坏纤维化发生的新治疗靶点具有重要临床意义。微血管异常和血管重塑在IPF发病机制中至关重要，但具体致病的内皮细胞（endothelial cells, ECs）亚群及其分子网络尚不清楚。非典型趋化因子受体1（atypical chemokine receptor 1, ACKR1）被认为与多种器官纤维化相关，但其在肺纤维化中的机制尚未阐明。为解析上述问题，研究人员开展了系统研究，整合了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与空间转录组学技术，对无锡市人民医院胸肺移植科收集的4例IPF患者和4例健康供体肺组织进行分析；同时结合博来霉素（bleomycin, BLM）诱导的小鼠模型、内皮特异性Ackr1敲低（shAckr1）小鼠、雪貂BLM模型及人精密肺切片（human precision-cut lung slices, hPCLS）等体内外模型。关键技术手段包括10x Genomics单细胞捕获、10x Visium空间转录组（RCTD算法映射细胞类型）、伪时间轨迹推断（Monocle 2）、基于结构的虚拟筛选、表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）、免疫共沉淀-质谱（co-immunoprecipitation/mass spectrometry, Co-IP/MS）、多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）及转录组测序（RNA-seq）。

研究首先通过scRNA-seq对CD45^-肺细胞进行分析，发现IPF肺组织中静脉内皮细胞（Venous-0）显著扩增，该亚群被注释为ACKR1⁺ ECs，其特异性高表达ACKR1和IGFBP7。多重免疫荧光和流式细胞术证实该亚群在IPF组织中比例显著增加（44% vs 3%），且其丰度与患者年龄、肺气肿百分比、一氧化碳弥散量（diffusing capacity of the lung for carbon monoxide, DLCO）及用力肺活量（forced vital capacity, FVC）显著相关，提示其扩增反映疾病严重程度。功能富集和伪时间轨迹分析显示，ACKR1⁺ ECs代表一种终末分化的静脉内皮表型，参与炎症、纤维化、低氧及EndMT相关通路。空间转录组学进一步在IPF组织中鉴定出特异存在于纤维化区域的“ACKR1⁺内皮-成纤维细胞生态位”（CC6），发现ACKR1⁺ ECs与成纤维细胞在空间上紧密耦联，且其空间丰度与组织学纤维化严重程度显著相关。在体内验证中，内皮特异性Ackr1敲低小鼠在BLM攻击后表现出体重丢失减少、生存率提高，肺组织胶原沉积（Ashcroft评分和羟脯氨酸含量）显著降低，α-SMA和FN1表达下调，证实内皮ACKR1缺失可减轻肺纤维化。

机制研究表明，成纤维细胞来源的TGF-β通过SMAD2轴直接上调内皮ACKR1转录。Transwell共培养和双荧光素酶报告基因实验证实TGF-β激活SMAD2并结合于ACKR1启动子片段，驱动其表达。在微环境调控方面，研究人员发现ACKR1⁺ ECs通过CCL2转胞吞作用介导CCR2⁺单核细胞向肺组织的募集。体内外实验表明，内皮Ackr1敲低或CCL2中和抗体均可抑制单核细胞浸润。同时，ACKR1⁺ ECs分泌的IGFBP7通过CD93/PI3K/AKT信号轴促进巨噬细胞向促纤维化的M2表型极化。经ACKR1⁺ ECs教育的巨噬细胞可进一步促进人肺成纤维细胞（human lung fibroblasts, HLFs）向肌成纤维细胞（myofibroblasts）分化。在细胞自主机制方面，RNA-seq和免疫印迹显示ACKR1过表达可驱动EndMT，伴随机体标志物丢失和间质标志物获得。Co-IP/MS鉴定出内吞衔接蛋白NUMB为ACKR1结合蛋白。机制上，ACKR1通过NUMB的磷酸酪氨酸结合（phosphotyrosine-binding, PTB）结构域与其结合，竞争性抑制NUMB对NOTCH1的溶酶体降解，使NOTCH1进入RAB11⁺回收内体（recycling endosomes），从而在翻译后水平维持Notch信号过度激活。通过基于结构的虚拟筛选，研究人员从约25,000种化合物中鉴定出1F-果呋喃基新糖（1F-Fructofuranosylnystose, 1F-FOS）为直接ACKR1抑制剂。SPR分析证实其直接结合ACKR1（K_d = 5.91 × 10^-6 M）。在BLM小鼠模型中，1F-FOS减少体重丢失和死亡率，降低Ashcroft评分、羟脯氨酸含量及NOTCH1/HES1信号激活，并抑制CCR2⁺单核细胞浸润。在来自IPF患者的hPCLS中，1F-FOS处理5天使胶原沉积减少，Ashcroft纤维化评分降低。在雪貂BLM模型中，1F-FOS改善微CT高密度面积（high attenuation area, HAA）、肺功能指标（吸气容量和FEV_0.4/FVC比值），并抑制纤维化基因表达。

讨论部分指出，本研究鉴定出ACKR1⁺ ECs作为IPF的关键致病枢纽，提出了空间受限的“ACKR1⁺内皮-成纤维细胞生态位”新概念。与以往弥漫性损伤模型不同，本研究证实该生态位中成纤维细胞通过TGF-β/SMAD2轴诱导ACKR1⁺ ECs活化，而ACKR1⁺ ECs反过来通过转胞吞CCL2招募单核细胞、分泌IGFBP7极化M2巨噬细胞，形成促纤维化正反馈环路。在机制上，本研究揭示了ACKR1此前未知的非典型信号功能：其通过与NUMB PTB结构域结合，竞争性拯救NOTCH1免于溶酶体降解并导向回收，从而在不改变NOTCH1转录的情况下维持Notch信号持续激活并驱动EndMT，这是对内皮生物学的概念性突破。1F-FOS作为小分子抑制剂在小鼠、雪貂和人体外模型中展现出的疗效，凸显了其靶向肺血管生态位进行精准抗纤维化的临床转化潜力。研究结论部分指出：综上所述，研究人员通过整合分析揭示了ACKR1⁺ ECs作为肺纤维化关键驱动因素的核心致病机制，通过表征其空间分布、细胞间通讯网络以及ACKR1调控的NUMB/NOTCH1胞内调节机制，定义了IPF的核心致病机制。此外，ACKR1抑制剂1F-FOS在小鼠、雪貂和人体外模型中的抗纤维化疗效验证了ACKR1作为可行治疗靶点的价值。这些发现共同提供了靶向药理学策略以破坏IPF纤维化微环境的理论基础。