种系致病性BRCA1变异使女性易患乳腺癌和卵巢癌。尽管功能证据不断积累，已报道的BRCA1单核苷酸变异中仍有超过半数缺乏明确的临床解读。此外，变异效应在不同细胞类型间的一致性在很大程度上尚未被探索。本研究在人HAP1细胞中开展BRCA1饱和基因组编辑（SGE），对4,113个此前未经检测的变异进行评分。同时，研究人员在人乳腺上皮细胞（HMECs）中建立了SGE检测方法，从而能够跨细胞系、药物处理和遗传背景比较变异效应。研究人员鉴定出538个通过不同机制影响基因功能的变异。HAP1功能评分在区分已知致病性与良性变异方面具有近乎完美的准确性。然而，值得注意的是，近半数HAP1功能缺失（LoF）变异在HMECs中被评为中性。研究人员证明，评分不一致的变异为亚效（hypomorphic）等位基因，并赋予中等癌症风险。总体而言，该工作展示了跨细胞模型开展SGE如何改善罕见变异的功能解读。
研究背景与问题 罕见遗传变异的临床解读仍是难题，临床重要性高的基因中大量变异意义未明（VUS）。功能证据可提示变异致病或良性及其表型效应程度，对理解疾病外显率和严重程度具有重要意义。多重变异效应检测（MAVEs）可实现单次实验对数以千计变异的系统比较，高质量MAVE数据可改善临床变异分类。饱和基因组编辑（SGE）利用CRISPR在内源位点引入变异，在BRCA1、BRCA2、VHL、BAP1、RAD51C、PALB2等抑癌基因致病性变异区分中表现突出。但SGE及其他MAVE的局限在于只能局限于一种适合高通量实验的细胞类型。BRCA1是致病性种系变异显著增加女性乳腺癌和卵巢癌风险的抑癌基因，针对致病性变异携带者的预防策略可降低癌症相关风险，已有数十种检测方法被部署。然而尚无研究系统评估变异效应在细胞类型间的一致性程度，而这对许多已有MAVE数据的基因至关重要，因为来自单一细胞类型的证据足以改变变异的临床管理方式。为此，研究人员在HAP1细胞中开展SGE检测4,740个BRCA1变异，并在人乳腺上皮细胞（HMECs）中建立额外SGE检测以系统比较变异效应，揭示大量跨模型效应不一致的变异，并深入认识变异如何影响BRCA1功能。
关键技术方法 研究采用优化的HAP1细胞SGE流程，对RING与BRCT结构域之外的11个优先区域（含启动子、5′非翻译区、外显子6、10、11、12及内含子11深部）构建同源定向修复（HDR）文库，通过第5天与第14天扩增子测序计算功能评分，并以靶向RNA测序计算RNA评分。在HMECs中，研究人员先通过81 kb缺失敲除一条BRCA1等位基因，建立BRCA1+/−人乳腺上皮细胞系，结合多西环素诱导Cas9表达、DNA-PK抑制剂NU7441处理及奥拉帕利处理开展SGE。研究还构建RNF168−/− HMEC系及表达p.L1414R、p.M1411T的克隆系。样本队列来源为BRIDGES研究（66,859例女性乳腺癌病例与271,189例对照）与UK Biobank的病例对照数据。
研究结果 HAP1细胞中优化的SGE检测：在11个新检测区域共对3,843个单核苷酸变异（SNVs）和270个小缺失赋予功能评分，覆盖98.0%的可能SNVs，重复间高度可重复；新检测区域中6.5%变异评为LoF、1.9%为中间型，功能影响变异比例低于RING与BRCT结构域编码区。跨BRCA1区域的变异效应图谱：无义变异与经典剪接位点变异一致缺失，外显子1剪接供体位点及外显子5供体位点变异均评为中性；LoF错义变异几乎局限于卷曲螺旋（CC）结构域，功能评分与已发表同源重组（HR）活性及FoldX ∆∆G相关；外显子6与10区域仅鉴定7个LoF错义变异，均伴低RNA评分和高SpliceAI评分，提示剪接破坏为因果机制；启动子与5′UTR中低功能评分集中于保守E2F结合位点，5′UTR变异c.−86C>A因产生框外开放阅读框评为LoF；内含子11深部变异c.4185+4105C>T评为LoF，邻近的c.4185+4108C>G亦导致LoF。乳腺上皮细胞SGE检测的建立：在HMECs中共评分2,157个变异（占文库86.5%），无义变异显著缺失（平均功能评分−1.91，同义变异为0.02），以错误发现率0.01鉴定235个显著缺失变异。跨细胞系变异效应比较：393个HAP1 LoF变异中仅224个（57.0%）在HMECs中显著缺失，100个HAP1中间型变异中仅2个在HMECs缺失；CC结构域全部HAP1 LoF错义变异在HMECs中评为中性，外显子12受体位点经典剪接变异在HMECs中中性，提示替代受体位点所致框内缺失保留功能；内含子11深部LoF变异在两细胞系中评分高度一致，而5′UTR与启动子LoF变异在HMECs中中性。功能冗余解释细胞类型特异性效应：奥拉帕利处理HMECs后61个变异选择性评为LoF，其中78.7%在HAP1中亦为LoF；RNF168−/− HMECs中许多CC结构域错义变异评分降低，p.L1414R与p.M1411T克隆系中RNF168诱导的插入缺失被耗竭，且单链模板修复（SSTR）编辑增加，表明CC结构域错义变异仅损害HMECs中特定BRCA1功能。致病性变异的准确区分：HAP1的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.997，HMEC为0.977；98.1%的良性/可能良性（B/LB）变异为一致中性，仅81.3%的致病/可能致病（P/LP）变异为一致LoF；评分不一致变异在VUS中富集，且在gnomAD与All of Us中频率高于一致LoF变异。从SGE数据预测临床风险：仅HAP1 LoF类与乳腺癌风险显著相关（荟萃分析比值比OR=5.86），HAP1中间型无显著风险升高；HAP1-LoF、HMEC-中性变异风险中度升高（OR=3.28），一致LoF变异风险更高（OR=12.97）；全部9个与中等风险相关的变异均在HAP1中显著缺失而在未处理HMECs中不缺失。临床变异解读证据：以高斯混合模型确定致病几率并赋予证据等级，调整后仅影响4.0%的最终证据编码；合并两细胞系证据后，12.3%变异获至少4分支持致病，77.8%获至少4分支持良性。
讨论与结论 HAP1与HMEC数据均能高特异性区分致病变异，但HAP1总体表现更优，源于其对BRCA1部分功能损害的敏感性，可能与TDP1剪接变异、SLFN11高表达及单倍体特性有关。CC结构域错义变异在HMECs中保留其他BRCA1功能（如促进DNA末端切除），p.M1411T与p.L1414R克隆系SSTR升高支持此点。RING、BRCT、CC结构域之外不足1%的错义变异为LoF，支持对结构域外错义变异赋予良性强证据的指南。两细胞系均鉴定出致病的深内含子剪接破坏变异。启动子与5′UTR变异效应可能具细胞类型特异性，用于判定此类变异时应谨慎。跨细胞系数据的价值在于：79.3%变异获一致证据从而增强分类依据；HMEC检测有助于识别外显率降低的致病变异；第二细胞系证据可化解中间型评分的模糊性。研究局限包括HMECs中HDR效率较低致评分精度不足、需更多重复以界定中间效应、并非所有细胞系特异性效应均获解释、需更大队列确定评分不一致变异的精确风险估计。研究结论为：该研究揭示了RING与BRCT结构域之外影响BRCA1功能的变异，将功能证据扩展至数千个此前缺乏数据的变异；通过证明变异效应常在细胞系间存在差异，表明可利用多种SGE检测改善变异解读。
