异常的内吞作用长期以来与上皮可塑性和肿瘤发生相关，但其在肿瘤进展和转移中的因果作用的直接体内证据一直缺乏。在此，研究人员鉴定并在分子水平上表征了乳腺上皮细胞中一种此前未被认识的E-钙黏蛋白（ECAD）内化形式。该过程由内吞衔接蛋白Epsin 3（EPN3）介导，通过糖脂-凝集素（GL-Lect）驱动的内吞作用实现，需要galectin-3和Eps15家族衔接蛋白参与。研究人员进一步定义了该通路的分子基础，鉴定了EPN3特异性相互作用表面，该表面促进ECAD簇集和galectin-3募集，从而驱动非网格蛋白依赖的ECAD内化。利用EPN3敲入小鼠模型，研究人员证明GL-Lect驱动内吞作用的失调会破坏乳腺形态发生，诱导上皮-间质可塑性（EMP），并激活与组织重塑和腺泡生成相关的转录程序。这些改变与ERBB2/Neu乳腺癌基因协同作用，加速肿瘤发生并促进肺转移。重要的是，ECAD内吞增强在完整乳腺上皮中被直接证实，并被证明是形态发生和侵袭表型的基础。GL-Lect机制的药理学抑制可抑制ECAD内化，并在离体条件下逆转形态发生、极性和侵袭表型，为治疗靶向提供了概念验证。这些发现确立了GL-Lect驱动内吞作为乳腺上皮可塑性的生理调节因子。当其失调时，驱动转移进展，并揭示了乳腺癌中一个可操作的治疗脆弱性。
**研究背景与科学问题**
上皮-间质转化（EMT）是一个涉及转录和表型变化的动态过程，可改变细胞极性、黏附和运动能力，在发育和组织重塑中发挥重要作用，同时也是癌症侵袭和转移的关键驱动因素。然而，成功的转移定植需要反向的间质-上皮转化（MET）在远处部位重建上皮特征。EMT并非二元事件，而是中间态或杂合态的连续谱——称为上皮-间质可塑性（EMP），其特征是上皮和间质标志物的共表达。处于这些亚稳态的细胞表现出增强的可塑性，能够在侵袭性和增殖性表型之间动态切换。就乳腺而言，这种可塑性对导管分支和退化等生理过程以及乳腺癌进展、侵袭和转移播散等病理事件均具有重要意义。
近期证据表明，EMP不仅受转录程序调控，还受控制上皮黏附的翻译后机制调控。特别是E-钙黏蛋白（ECAD），作为黏附连接的核心组分，可通过内吞运输而非仅通过转录抑制进行动态调控。通过调节黏附分子的内吞途径和细胞内运输，细胞可以更灵活地在表型状态之间可逆转换。这些观察将注意力转向膜运输作为上皮可塑性的重要调节因子，尽管调控这些事件的分子机制仍不完全清楚。
内吞运输的改变可影响生长因子受体信号传导、细胞黏附和迁移，从而促进肿瘤起始、侵袭和转移播散。然而，尽管有大量证据将内吞缺陷与癌症联系起来，但直接证明某一特定内吞机制的失调足以在体内驱动上皮可塑性和转移的证据仍然缺乏。在此背景下，研究人员先前将内吞蛋白Epsin 3（EPN3）鉴定为正常样乳腺上皮细胞系MCF10A中EMP的驱动因子。EPN3是内吞衔接蛋白epsin家族的成员，该家族还包括Epsin 1（EPN1）和Epsin 2（EPN2）。EPN3过表达促进ECAD内吞，破坏细胞间连接，激活β-连环蛋白信号传导，诱导间质基因表达，并建立TGFβ自分泌环路，共同增强癌症干细胞特征和侵袭性。这些效应是EPN3特异性的，其旁系同源物EPN1不能复制。重要的是，EPN3在约50%的乳腺癌中过表达，其中10%存在基因扩增，其中一半病例表现出乳腺癌基因ERBB2（HER2）的共扩增。因此，EPN3是少数表现出遗传改变的内吞衔接蛋白之一，因此可在肿瘤中被明确检测到。临床上，EPN3高表达与不良预后和增加的远处转移风险相关，且独立于ERBB2状态。
这些观察将EPN3确定为临床相关的上皮可塑性调节因子，并提示细胞间连接的内吞重塑可能是乳腺癌进展的重要机制。然而，EPN3促进ECAD内化的内吞机制、赋予其相对于密切相关的EPN1特异性的分子决定因素，以及该过程在乳腺生物学中的生理相关性仍不清楚。因此，研究人员旨在确定EPN3介导的ECAD内吞的分子机制，鉴定负责其特异性的决定因素，并利用互补的细胞、类器官和基因工程小鼠模型建立该内吞通路的失调是否直接控制乳腺上皮可塑性、组织形态发生和乳腺癌进展。
**主要技术方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：免疫荧光（IF）内吞实验和流式细胞术（FACS）检测ECAD内化；免疫电子显微镜（EM）分析内吞结构形态；免疫共沉淀（co-IP）和GST pull-down分析蛋白相互作用；结构化照明显微镜（SIM）分析膜上蛋白簇集；AlphaFold3预测蛋白复合物结构；单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析乳腺上皮细胞亚群转录组；构建K5特异性条件性EPN3敲入（EPN3-KI）小鼠模型并与MMTV-NeuN转基因小鼠杂交；三维类器官培养进行极性、侵袭和分支形态发生实验；METABRIC乳腺癌队列生存分析。研究中使用了MCF10A、BT474等细胞系以及EPN3-KI、MMTV-NeuN和EPN3-KI:MMTV-NeuN小鼠模型。
**研究结果**
EPN3通过GL-Lect机制和Eps15家族蛋白促进非网格蛋白依赖的ECAD内吞
研究人员首先检测了EPN3诱导的ECAD内化对网格蛋白介导内吞（CME）的依赖性。通过敲低（KD）主要网格蛋白衔接蛋白AP2，发现对EPN3驱动的ECAD内吞无影响，而转铁蛋白（Tf）受体的内化显著受损。单敲或双敲Eps15/Eps15L1实验表明，单独沉默Eps15或Eps15L1均显著损害ECAD内吞，联合敲低未产生进一步抑制，表明这些蛋白发挥必要的非冗余作用。电子显微镜分析显示，MCF10A-EPN3细胞中ECAD内化水平升高，质膜上大多数ECAD定位于无包被的管状内陷（TIs），仅极小部分存在于网格蛋白包被小窝（CCPs）中。抑制剂筛选实验显示，抑制肌动蛋白聚合（CK666）、GSL合成（Genz-123346）或galectin-聚糖相互作用（乳糖）均显著降低ECAD内吞。使用选择性非膜渗透性Gal3抑制剂I3急性处理也产生相同效果，且I3与Gal3 KD联合未进一步降低ECAD内吞，证实了抑制剂的特异性。Gal3 KD和/或I3处理减弱了EPN3过表达细胞的增强迁移表型。Alexa-488标记的Gal3与ECAD共内化成像显示，MCF10A-EPN3细胞中共定位显著增加。
内吞的ECAD运输至早期内体和高尔基体
研究人员追踪了ECAD的内吞后命运。在对照细胞中，内化的ECAD在早期时间点（10分钟）到达EEA1阳性内体，共定位在30分钟达到峰值后在90分钟下降。在EPN3过表达细胞中，ECAD向EEA1阳性区室的运输显著增加。在两种条件下，仅极小部分ECAD与溶酶体标志物Lamp-1共定位，表明大多数内化的ECAD未被靶向溶酶体降解。相反，大量内化的ECAD在较晚时间点定位于高尔基体，共定位在90分钟达到峰值，且EPN3过表达细胞中高尔基体相关ECAD更为丰富。这些数据表明ECAD遵循先前描述的其他GL-Lect内吞货物的运输路线，涉及逆行运输至高尔基体，仅小部分靶向溶酶体降解。
EPN3在ECAD内吞中特异性的分子基础
鉴于EPN3和EPN1之间的高度序列同源性和保守结构域组织，研究人员生成了EPN3-EPN1嵌合蛋白并在MCF10A细胞中表达以鉴定负责EPN3特异性表型的分子决定因素。交换ENTH结构域未改变EPN3功能，也未赋予EPN1类似EPN3的表型。类似地，EPN3近端区域（PR）不能解释EPN3的功能特异性。相反，C端区域表现出最大的差异性，似乎包含EPN3特异性活性的关键决定因素。包含中央区域（CR）或远端区域（DR）的嵌合体表现出部分表型拯救，其中EPN3-DR显示更高的内吞速率。同时替换两个区域（EPN3-CR-DR）完全恢复了EPN3特异性表型。这些结果表明CR和DR区域均贡献于EPN3在ECAD内吞中的独特功能特性。
EPN3中的双重Eps15/Eps15L1结合区域介导ECAD内吞
为阐明EPN3的CR和DR区域赋予功能特异性的分子基础，研究人员评估了野生型（WT）和嵌合EPN3和EPN1蛋白与Eps15家族成员的相互作用。免疫共沉淀（co-IP）实验显示，WT EPN3与Eps15和Eps15L1的结合显著强于EPN1。EPN3-DR嵌合体表现出与Eps15和Eps15L1结合的几乎完全拯救，而EPN3-CR嵌合体显示较低但一致的拯救。两个区域均为最佳结合所必需。在DR结构域内，三个NPF基序被鉴定为候选结合位点。将这些基序定点突变为NAA消除了与Eps15和Eps15L1的结合并逆转了EPN3特异性表型。AlphaFold3建模显示，EPN3-Eps15L1相互作用的最可能构型涉及三个NPF与三个EH结构域结合（84%的模型），而EPN1-Eps15L1的优先结合构型涉及两个NPF和两个EH结构域（60%的模型）。CR结构域分析揭示了EPN3中存在而EPN1中缺失的两个序列基序——SWG基序和DPF基序。在EPN3-CR嵌合体中，DPF基序突变为DAA显著损害了与Eps15/Eps15L1的结合并抑制了ECAD内吞，而SWG基序突变无可检测效应。这些数据鉴定出EPN3中的双重Eps15/Eps15L1结合表面，由CR结构域内的DPF基序和DR结构域内的三个NPF基序组成，共同赋予该蛋白在介导ECAD内吞中的功能特异性。
EPN3-Eps15/Eps15L1复合物促进ECAD簇集和Gal3募集
研究人员探究了Gal3、ECAD和EPN3是否在质膜上形成功能性复合物。Gal3 pull-down实验证实了在基础条件下Gal3、ECAD和EPN3的关联，而网格蛋白和AP2未富集。EPN3过表达后，ECAD与His-Gal3的结合显著增强。Eps15和Eps15L1均在Gal3 pull-down中与ECAD和EPN3一起被检索到。单独敲低Eps15或Eps15L1均显著损害ECAD和EPN3向His-Gal3的募集，表明Eps15和Eps15L1对复合物形成至关重要。GST pull-down实验显示ECAD直接结合Eps15和Eps15L1，但不结合EPN3或EPN1，证实Eps15/L1可作为EPN3与ECAD之间的桥梁。使用SIM观察到，EPN3过表达对质膜上ECAD簇总数仅有适度影响，但显著增加了Gal3-ECAD共簇的数量和大小。Eps15 KD和Eps15L1 KD均可逆转此表型。此外，EPN3过表达细胞中Eps15和Eps15L1共簇也增加。
小鼠乳腺中EPN3过表达诱导异常形态发生
为评估EPN3诱导的ECAD内吞的病理生理相关性，研究人员生成了角蛋白5（K5）特异性条件性EPN3-KI小鼠。这些小鼠在包括乳腺上皮在内的上皮组织中过表达人EPN3转基因。EPN3-KI小鼠乳腺上皮细胞中EPN3表达约为对照细胞的15倍，与携带EPN3基因扩增的BT474乳腺癌细胞相当。免疫组化证实EPN3转基因在乳腺导管上皮中表达，涵盖基底/肌上皮（K14阳性）和腔面（K8阳性）层。EPN3-KI小鼠按孟德尔比例出生，12月龄前无明显的发育异常或乳腺肿瘤形成迹象。然而，在18和29周龄处女雌鼠中观察到乳腺增生、次级和三级导管分支增加以及腺泡样结构形成。这些缺陷在青春期早期（6周）不可见。流式细胞术分析显示EPN3-KI腔面细胞中Itga6/CD49f质膜信号显著增加。
EPN3过表达诱导EMP和腺泡生成/泌乳样特征的上调
为获得高分支表型的分子机制见解，研究人员对18周龄EPN3-KI和对照小鼠的EpCAM阳性细胞进行了scRNA-seq。从7405个对照细胞和6783个EPN3-KI细胞获得了高质量数据。UMAP聚类揭示了12个 distinct 簇，分为三个主要上皮类别：基底/肌上皮（BM）、腔面祖细胞（LP）和腔面激素感应（LH）细胞群体。两组间这些群体的分布无显著差异。差异表达基因分析显示1161个基因在三个亚群中上调，而185个基因下调。功能富集分析显示EPN3-KI小鼠中EMT相关程序显著富集，特别是在BM群体中，包括参与细胞黏附、细胞外基质组织和组织重塑的基因。此外，尽管ECAD表达在转录水平未下调（实际上略有增加），但ECAD蛋白水平有小幅但可重复的降低（约25%），与EMP而非完全EMT的建立一致。功能富集分析还显示LP群体中信号通路（如TGFβ和雌激素）和代谢通路（如糖酵解、mTORC、胆固醇稳态和脂肪酸代谢）上调。此外，"泌乳"是LP细胞中EPN3过表达后上调最高的通路之一，由通常与妊娠和泌乳相关的基因表达驱动。模块评分分析显示EPN3-KI小鼠中"循环"细胞增加约三倍，Ki67阳性细胞的IHC分析进一步证实了这一点。
EPN3促进小鼠乳腺上皮中的ECAD内吞
研究人员首先分析了FFPE组织乳腺切片中ECAD的定位。在对照小鼠中，ECAD染色在细胞间连接处强烈富集且组织良好，而EPN3-KI腺体显示较弱且组织较差的连接ECAD染色。为直接评估这些改变是否与ECAD内吞增加相关，研究人员分析了原代乳腺上皮细胞中的ECAD内化。与MCF10A-EPN3细胞中的观察一致，EPN3-KI乳腺上皮细胞表现出显著增加的ECAD内吞。重要的是，竞争性galectin抑制剂乳糖或特异性Gal3抑制剂I3处理可减少此效应。两种抑制剂也降低了对照乳腺上皮细胞中的基础ECAD内吞，表明该通路在生理条件下运作。为在更好地保留乳腺上皮天然结构的设置中验证这些发现，研究人员在离体维持的完整乳腺腺体移植物中评估了ECAD内吞。EPN3-KI乳腺腺体表现出显著增加的ECAD内化，I3处理可逆转此效应。
ECAD的GL-Lect驱动内吞是EPN3介导的上皮重塑和形态发生所必需的
为研究EPN3-KI小鼠中观察到的形态发生改变是否与ECAD内吞直接相关，研究人员建立了一系列离体实验以评估原代细胞侵袭、3D类器官中的上皮结构和极性以及分支形态发生和泌乳程序激活。EPN3-KI乳腺细胞在Transwell侵袭实验中表现出增加的侵袭能力，乳糖或I3处理有效逆转了此表型。侵袭表型还依赖于Itga6，功能阻断抗体显著损害了EPN3介导的侵袭，但对ECAD内吞无可检测效应。为确定ECAD内吞改变是否也影响上皮极性，研究人员在Matrigel/Collagen I中培养了EPN3-KI和对照小鼠来源的原代类器官。对照类器官显示良好组织化的上皮结构，其特征在于基底外侧ECAD定位和顶端aPKCζ染色。相反，EPN3-KI类器官表现出上皮极性和连接组织的严重破坏。乳糖或I3处理很大程度上恢复了ECAD定位和类器官结构。研究人员还建立了离体分支形态发生实验。对照小鼠类器官形成各种结构类型，包括类似体内乳腺导管的伸长、分支结构和类似含多个腺泡导管的多叶结构。相反，EPN3-KI小鼠来源的类器官表现出向多叶结构的显著转变，反映了体内观察到的腺泡生成增加。使用乳糖、I3或Genz抑制ECAD内吞导致圆形或发育不良类器官百分比显著增加，同时多叶结构数量减少。RT-qPCR分析证实EPN3过表达诱导酪蛋白（Csn1s1）和乳白蛋白（Lalba）表达上调，抑制ECAD内吞后逆转。
EPN3过表达加速ERBB2驱动的乳腺肿瘤发生和肺转移
研究人员假设EPN3-KI小鼠中观察到的侵袭性、泌乳样EMP表型可与其他癌基因协同作用使乳腺易患肿瘤。为此，研究人员将EPN3-KI小鼠与致瘤性MMTV-NeuN小鼠杂交。MMTV-NeuN小鼠表现出乳腺发育显著缺陷，其特征在于乳腺导管生长减少和脂肪垫侵袭受损，而EPN3-KI:MMTV-NeuN小鼠中此表型被逆转。此外，EPN3-KI:MMTV-NeuN小鼠与MMTV-NeuN对照小鼠相比表现出更早的肿瘤发生。为评估EPN3过表达对转移的影响，研究人员开发了RT-qPCR实验通过检测组织中大鼠NeuN（Rn-Erbb2）mRNA的相对水平来量化转移负荷。部分EPN3-KI:MMTV-NeuN小鼠表现出显著升高的肺Rn-Erbb2和Lalba mRNA表达，表明NeuN/Lalba表达肿瘤细胞的播散增加。IHC分析证实这些肺样本中存在ERBB2阳性大转移灶。值得注意的是，研究人员发现原发肿瘤大小与肺大转移灶的出现之间无相关性。最后，EPN3-KI:MMTV-NeuN小鼠来源的原代乳腺上皮细胞表现出上调的ECAD内吞和增加的侵袭性，两种表型均被乳糖或I3处理抑制。研究人员进一步 interrogation 了METABRIC队列。在携带CDH1突变的肿瘤中，EPN3表达与患者预后无关联。相反，在CDH1野生型肿瘤中，高EPN3表达鉴定出预后显著较差的患者，并在多变量分析中保持为独立预后预测因子。EPN3的预后影响仅限于表达高水平ECAD的CDH1野生型肿瘤（上表达四分位数Q3-Q4），而在低ECAD表达肿瘤（Q1-Q2）中未观察到显著关联。
**讨论与结论**
异常内吞作用已被牵涉到肿瘤发生的多个步骤；然而，其在一癌症进展中作用的直接体内证据仍然有限。在此，研究人员证明一种非网格蛋白依赖的ECAD内吞形式——即依赖GSLs、Gal3和内吞衔接蛋白EPN3和Eps15/Eps15L1的GL-Lect机制——驱动异常乳腺形态发生并增加乳腺癌转移进展的易感性。值得注意的是，这种内吞机制可用减少离体乳腺上皮细胞侵袭能力的抑制剂进行药理学靶向，为乳腺癌治疗提供了新途径。
在机制上，EPN3定义了一个与其旁系同源物EPN1不同的独特内吞模块。通过包含其远端区域中经典NPF三联体和中央区域中非经典DPF基序的双重相互作用界面，EPN3与Eps15/Eps15L1异二聚体结合。数据表明Eps15和Eps15L1在此过程中作为异二聚体发挥作用。这种分子构型促进质膜上多价EPN3-Eps15/Eps15L1复合物的形成，在那里它们协调ECAD簇集并促进细胞外Gal3募集。Gal3是一种β-半乳糖苷结合凝集素，大量存在于细胞外空间和生物体液中，尽管缺乏常规分泌信号。细胞外Gal3最初为单体，已被证明可寡聚化至四聚体并多价结合糖基化蛋白和GSLs，驱动膜纳米结构域和管状内吞小窝的形成，从中产生非网格蛋白依赖载体。ECAD包含四个N-糖基化位点，其中一个由复杂N-聚糖组成，可与Gal3相互作用。由于每个ECAD部分因此可能仅结合一个Gal3单体，有效的GL-Lect驱动内吞需要ECAD在质膜上的簇集，使Gal3寡聚体能够桥接ECAD和GSLs。研究人员提出EPN3从胞质侧协调此过程，作为分子组织者将内吞衔接蛋白网络与细胞外Gal3驱动的纳米结构域耦合。该模型建立了胞质内吞支架与细胞外凝集素驱动结构域组织之间的直接结构和功能桥梁，揭示了内吞跨区室协调的新范式。
在组织水平上，乳腺上皮中EPN3过表达放大了生理性GL-Lect驱动内吞机制，导致EMP程序的诱导。这些分子效应表现为处女腺体中增强的导管分支和腺泡样结构。确实，黏附连接的内吞重塑以及极性丧失和EMP激活驱动上皮侵袭和乳腺组织重塑。此外，EPN3-KI乳腺腺体表现出显著的代谢改变，特别是脂质和胆固醇代谢增加。这些变化伴随着腺泡生成和泌乳转录程序的激活，特别是在LP细胞——腺泡祖细胞中。在正常腺泡生成和泌乳过程中，腺泡细胞通过增强的细胞内运输经历细胞间连接的广泛重塑，支持膜扩张和脂质代谢增加。类似地，在EPN3-KI腺体中，异常腺泡生成可能源于ECAD内吞增加，导致细胞间连接破坏和上皮极性丧失。两个过程都需要大量质膜重塑，驱动对脂质和胆固醇的需求增加。这些表型共同表明，在乳腺癌中，EPN3过度激活劫持了生理性发育内吞程序以驱动形态发生可塑性。与此一致，内源性EPN3在人泌乳特征中上调，提示EPN3在泌乳期间组织重塑中的潜在生理作用。
在功能上，EPN3-Gal3轴是离体侵袭、上皮极性丧失和分支形态发生所必需的。Gal3或GSL合成的药理学抑制逆转ECAD内化，抑制侵袭，并恢复上皮结构和极性，强调了GL-Lect驱动内吞在这些过程中的因果作用。此外，当与NeuN/ERBB2癌基因激活结合时，EPN3过表达加速肿瘤发生并促进肺转移，可能将失调的ECAD内吞与体内转移能力联系起来。这些发现揭示，内源性内吞途径的异常参与可增强致癌信号传导和向侵袭和播散的表型进化。EPN3驱动的转移独立于肿瘤大小发生，表明转移潜能出现在肿瘤进化的早期。与此一致，研究人员先前发现内源性EPN3在原位到浸润性转变期间积累于乳腺导管癌的侵袭前沿，可能暗示GL-Lect机制作为转移进展的早期驱动因素。
研究人员的发现支持EPN3的生物学和临床影响取决于E-钙黏蛋白黏附复合物功能状态的模型。与CDH1突变是浸润性小叶癌的谱系定义事件而非侵袭性行为的独立决定因素的概念一致，EPN3表达在CDH1突变肿瘤中无预后价值。相反，EPN3是CDH1野生型肿瘤中不良结局的独立预测因子，但仅限于那些保留高ECAD表达的肿瘤。这种背景依赖性关联与机制发现相关。研究人员将EPN3鉴定为ECAD内吞的限速调节因子，调节质膜上E-钙黏蛋白的功能可用性，对其总体丰度影响甚微。因此，缺乏功能性ECAD系统的肿瘤，无论是由于CDH1突变还是ECAD表达显著降低，预计不会从EPN3过表达中获益，而E-钙黏蛋白功能正常的肿瘤仍然易受EPN3依赖性黏附连接重塑的影响。更广泛地说，研究人员的发现支持新兴概念，即转移进展不是由ECAD的不可逆丧失驱动，而是由其动态调控驱动。因此，研究人员提出EPN3通过调节膜运输而非ECAD表达促进乳腺癌进展，从而 enabling 有效转移播散所需的上皮可塑性。鉴于这种内吞机制可通过细胞外抑制接近，靶向Gal3-ECAD相互作用可能提供对抗乳腺癌中EMP驱动侵袭的手段。
