受体酪氨酸激酶（RTK）融合蛋白是约5%癌症中发现的一大类癌蛋白。然而，关于RTK融合蛋白如何传递致癌信号仍存在关键问题，包括这些主要位于细胞质的蛋白如何激活起源于质膜的 downstream 通路。融合蛋白常呈多聚体形式，并可在癌细胞中形成介观尺度凝聚体（condensates），而凝聚化（condensation）已被认为是从细胞质传递信号的必要机制。然而，凝聚体是否发挥因果作用，还是更小的"弥散"（diffuse）组装体足以转导信号，一直难以确立。本研究应用先进显微成像、单细胞分析和合成融合蛋白，以确定多聚化（multimerization）和凝聚化驱动细胞质RTK融合蛋白信号传导的原理。对于形成凝聚体的重要融合蛋白EML4–ALK，研究人员发现凝聚化与信号传导之间相关性差，且弥散相中存在大量EML4–ALK活性。合成RTK融合蛋白显示，ALK或RET结构域的细胞质二聚体——甚至组成型活性单体——足以在缺乏凝聚体的情况下诱导强烈的Ras–Erk信号传导，且不形成凝聚体的融合蛋白足以在体外和皮下肿瘤模型中转化细胞。对一系列其他癌症驱动RTK融合蛋白的分析显示，低阶多聚化在融合蛋白中广泛存在，而介观尺度凝聚化罕见且与信号传导不相关。研究结果表明，低阶多聚化足以驱动融合蛋白磷酸化，而后者是触发下游致癌信号传导的必要且充分条件。
研究背景：受体酪氨酸激酶（RTK）融合蛋白是约5%的跨组织类型癌症中存在的癌蛋白，已鉴定超过1000种，其共同结构为正常跨膜RTK的胞内片段通过染色体易位与另一蛋白的伴侣片段融合。伴侣片段通常具有同源寡聚化（homo-oligomeric）能力，寡聚化导致RTK结构域强制邻近并磷酸化，从而触发下游信号，模拟配体对跨膜RTK的作用。然而与跨膜RTK不同，融合蛋白常缺乏跨膜结构域而定位在细胞质中，远离质膜及其中的下游酶，但仍保留驱动持续性下游信号的能力，其机制尚不清楚。RTK融合蛋白可形成介观尺度蛋白凝聚体（0.1–1 µm长度的无膜区室），凝聚化曾被提出为细胞质融合蛋白信号传导的必要机制，凝聚体可提供组装和浓缩信号因子的细胞质平台。但近期筛选发现仅小部分致癌RTK融合蛋白形成介观凝聚体，引发对凝聚化必要性的质疑。由于低阶融合多聚化同时驱动凝聚化和激酶活性，干扰凝聚化常同时干扰多聚化，混淆了关于必要信号单元和凝聚体具体作用的结论，凝聚化对信号传导的因果性难以确立。
研究开展与结论：研究人员通过定量活细胞和固定细胞显微成像、单细胞和单凝聚体分析以及一系列天然和合成融合蛋白，克服上述挑战，确定RTK融合蛋白多聚化和凝聚化与信号传导及致癌潜力的关系。研究发现，激酶多聚化下游的磷酸化是触发细胞质RTK融合蛋白下游信号传导的必要且充分要素，而凝聚化并非必需。该工作确立了RTK融合蛋白信号传导的一般原理，并强调低阶、亚显微融合组装体在致癌信号转导中的重要性。
关键技术方法：研究主要采用定量活细胞与固定细胞荧光显微成像（含旋转盘共聚焦）、单细胞与单凝聚体图像分析、荧光相关光谱（FCS）测量胞内扩散时间与分子亮度以验证多聚化状态、合成卷曲螺旋（coiled-coil）介导的1聚体/2聚体/6聚体RTK融合构建、CluMPS相分离荧光报告探针检测亚显微组装、软琼脂集落形成实验及免疫缺陷小鼠（NSG）皮下肿瘤模型。细胞系来源包括HeLa、HEK 293T、Beas2B、NIH 3T3，患者来源H3122细胞（内源性EML4–ALK经HaloTag基因组标记）分别获赠于Trever Bivona实验室（UCSF）和Asmin Tulpule实验室（MSKCC）。
研究结果：
EML4–ALK信号传导与凝聚化不相关：在HeLa、Beas2B和HEK 293T细胞中，EML4–ALK(V1)凝聚程度差异显著（HeLa最强、HEK 293T最弱），但均驱动强烈ERK活化。四种EML4–ALK变体（V1、V2、V3、V5）的凝聚化与表达呈双相（biphasic）关系，在低–中等表达时最大、高表达时下降；而pERK与融合蛋白表达单调正相关，在弥漫性高表达细胞中最高。按表达分箱的单细胞分析显示任何表达区间内凝聚化均与信号传导无正相关。在内源性HaloTag标记EML4–ALK的H3122患者来源细胞中，凝聚化与表达正相关，但与ERK信号无相关性；补充外源GFP–EML4–ALK重现双相关系，高表达外源融合蛋白破坏内源凝聚体，高表达群体信号强而凝聚低。
增加EML4–ALK凝聚化不增加ERK信号：共表达GRB2–GFP可跨表达水平增强所有变体的凝聚化，但未在任何表达水平增加ERK信号；使用靶向GFP的CluMPS报告探针独立放大凝聚化，同样未增加信号。两种独立方法均不支持凝聚化作为下游信号驱动者或增强者的因果作用。
弥散相EML4–ALK活性对应下游信号：pALK与EML4–ALK表达强相关而与凝聚化相关性差。分区分析显示凝聚相pALK平均像素强度更高，但弥散相因体积分数更大而总积分pALK更高；高表达时凝聚相积分pALK平台化并下降，弥散相则随pERK同步上升。内源性GRB2:GFP作为ALK活性空间报告，在有无凝聚体的细胞中均出现胞质滞留（核排斥），且随融合表达增加而增强，ALK抑制剂（crizotinib，1 µM）可逆转该现象，表明凝聚体非EML4–ALK活性所必需。
合成ALK融合蛋白显示弥散相低阶组装足以驱动Ras–Erk信号：以GFP融合合成卷曲螺旋构建1聚体、2聚体（GCN4）、6聚体（HOTag3）ALK融合，FCS证实其扩散减慢和亮度增加符合设计。1聚体不形成凝聚体，2聚体几乎不形成，6聚体凝聚接近EML4–ALK；合成融合亦呈双相凝聚–表达关系。二聚化即足以将ALK及下游ERK信号激活至与6聚体和EML4–ALK相当的水平，即使在最低表达区间；单体ALK不传递ERK信号。二聚体ALK在软琼脂中形成与EML4–ALK相当的集落，并在NSG小鼠皮下成瘤，而1聚体和激酶失活2聚体（KD，D1270N）不成瘤。RET胞内片段合成融合表现类似。
强磷酸化条件下单体足以驱动融合信号：构建组成型活性（CA）ALK单体（F1147L），1mer-ALK(CA)不形成凝聚体，但呈浓度依赖性pALK强增加，并将pERK提升至接近EML4–ALK水平，伴GRB2胞质滞留增加；FCS证实其与野生型及激酶失活单体在扩散和亮度上无差别，排除隐秘小多聚体。RET组成型活性单体（M918T）同样可激活下游信号。1mer-ALK(CA)表达细胞可在免疫缺陷小鼠皮下成瘤，动力学略慢于EML4–ALK和2mer-ALK。结果表明激酶尾部磷酸化是关键信号步骤，多聚化本身并非严格必需。
低阶多聚化是致癌RTK融合蛋白的广泛特征：对8种细胞质融合蛋白（EML4–ALK、PPP1CB–ALK、CCDC6–RET、NCOA4–RET、GSN–NTRK1、TPM3–NTRK1、ETV6–NTRK3、TPM3–ROS1）分析显示凝聚化差异大，仅EML4–ALK(V1)、ETV6–NTRK3和NCOA4–RET凝聚显著，其余多为弥漫性；所有融合凝聚化与表达呈双相，而ERK信号与表达单调正相关（TPM3–ROS1例外，其信号亦呈双相但与凝聚趋势不同）。CluMPS报告显示除TPM3–ROS1外所有融合均形成亚显微组装，TPM3二聚体可能低于检测限。表明低阶多聚体足以驱动广泛致癌RTK融合蛋白的信号传导。
讨论部分总结：研究结果挑战了细胞质RTK融合蛋白致癌信号需求的现有认识，提出信号关键决定因素是RTK片段的强磷酸化，致癌融合中主要经伴侣结构域多聚化实现相邻RTK片段组成型交叉磷酸化；多聚化虽可触发介观凝聚体，但无证据表明凝聚体为信号所必需。研究利用单细胞分析和细胞间异质性理解凝聚化的情境依赖性，包括融合浓度、细胞类型和GRB2等下游适配器水平；像素级分析显示活性信号复合物存在于弥散相，与其他领域中介观凝聚化功能不明确的研究相呼应。伴侣介导的多聚化虽非必需，但在RTK融合中普遍，推测因其是易获得且强效的激活方式。研究结论与既往提示凝聚体因果作用的研究存在分歧，差异可能源于瞬时转染的实验变异及单细胞水平关联表达与信号的能力。研究不排除凝聚体在调节信号动力学、融合–适配器相互作用、亚细胞空间组织或特定细胞类型与组织微环境相关效应中的潜在作用，需未来研究检验。细胞质RTK融合蛋白如何经经典起源于质膜的致癌通路传导信号仍不清楚，但磷酸化的重要性与介观凝聚体的非必需性缩小了可能的机制解释范围。
研究结论翻译：研究结果表明，低阶多聚化足以驱动融合蛋白磷酸化，而后者是触发下游致癌信号传导的必要且充分条件。
