炎性介质的高效生物合成与分泌对于稳健的免疫应答不可或缺。该过程依赖于内质网（ER）中mRNA翻译与蛋白质加工的协调。RNA结合蛋白（RBPs）调控mRNA翻译的空间组织，然而RBPs如何调节炎性因子的产生与成熟尚不清楚。本研究揭示了RBP HuR在炎性因子mRNA翻译中的调控作用。研究发现，HuR与ER分子伴侣钙联蛋白（CANX）发生物理相互作用，将炎性因子mRNA、钙联蛋白质量控制复合物及易位子聚集于离散的ER亚结构域。机制上，HuR发生相分离并组装无膜RNA颗粒，这些颗粒选择性富集炎性mRNA，使相邻的钙联蛋白能够快速识别其对应的新生多肽。总之，本研究提供了RBPs通过相分离空间协调蛋白质翻译与加工的分子证据，为炎性介质高效产生的调控机制提供了新见解。
研究背景方面，当炎性刺激触发炎性细胞因子大量产生时，内质网（ER）承受升高的蛋白质加工负担。维持ER功能稳态，尤其是其高效的腔内质量控制和加工系统，对于确保该过程顺利进行至关重要。ER腔内进化出了精细的蛋白质质量控制机制，其中钙联蛋白（CANX）-钙网蛋白（CALR）循环作为核心监视系统发挥关键作用。该伴侣依赖型循环通过N-糖基化依赖和非依赖机制结合新生多肽，协调多种新生多肽的正确折叠与成熟。值得注意的是，ER中蛋白质折叠速率与ER膜上mRNA的翻译速率动态耦合：高效折叠维持高翻译活性，而折叠受损则触发反馈机制抑制翻译，从而在翻译与折叠之间建立双向适应性调控网络，防止ER过载和蛋白质聚集。然而，尽管ER对分泌性蛋白生物发生至关重要，哪些RBPs能够特异性调节ER功能以促进免疫应答中炎性细胞因子的高效合成及其分子机制仍不清楚。编码炎性介质的mRNA的一个定义性特征是其3‘非翻译区（3’UTR）内的AU富集元件（AREs）。HuR（也称为ELAVL1）作为关键的转录后正向调控因子，炎性刺激可调节其核质穿梭动力学，HuR与其他ARE结合蛋白竞争结合这些mRNA，发挥稳定作用。但HuR是否协调炎性刺激下的ER加工负荷并驱动炎性细胞因子的高效精准表达仍是待阐明的关键问题。
研究人员开展了以下研究：首先证实LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后HuR细胞质积累增强，RNA-IP-seq确认HuR结合多种炎性因子mRNA，敲低HuR显著抑制炎性因子的表达和分泌。利用SunTag-PP7系统监测ER上mRNA翻译，发现HuR敲低抑制含ARE/URE报告mRNA的ER翻译，但不影响无ARE报告mRNA的翻译；外源转染Cy5-TNFα-GFP mRNA实验表明HuR在不影响mRNA稳定性前提下调控翻译水平。通过蛋白质组学鉴定HuR互作蛋白，发现HuR与CANX直接相互作用，BLI和APEX2邻近标记确认HuR结合CANX的细胞质C端结构域。功能上，CANX敲低抑制炎性因子分泌，HuR敲低减弱CANX与易位子组分TRAPα及炎性因子的相互作用。荧光蛋白保护实验和亚细胞分级证实HuR通过CANX锚定于ER表面，并与靶mRNA共定位于ER上的颗粒结构。体外和细胞内实验证实HuR发生液-液相分离（LLPS），RNA增强其相分离，RNA-FISH验证内源性炎性因子mRNA与HuR和CANX共定位于胞质RNA颗粒中。结构域分析表明RRM1和RRM2结构域协同介导HuR在细胞内的相分离。最后，研究人员设计了CANX-C3肽段阻断HuR-CANX相互作用，并在小鼠急性肺炎模型中验证其抗炎效果。
关键技术方法方面，研究人员主要运用了：RNA免疫沉淀测序（RNA-IP-seq）鉴定HuR靶mRNA；SunTag-PP7翻译监测系统实时可视化ER上mRNA翻译过程；免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、邻近连接 assay（PLA）、生物层干涉术（BLI）、APEX2邻近标记和二聚化依赖荧光蛋白（ddFP）系统验证蛋白质相互作用；荧光蛋白保护（FPP）实验和生化蛋白酶保护实验确定亚细胞定位；光遗传学（CRY2）系统和荧光漂白恢复（FRAP）分析相分离动态；RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）检测mRNA定位；以及LPS诱导的小鼠急性肺炎模型进行体内验证。样本来源包括RAW264.7小鼠巨噬细胞系、HeLa细胞系、HEK293细胞系及C57BL/6小鼠。
研究结果方面，第一，HuR直接调控炎性因子的ER相关翻译和加工。通过siRNA敲低和SunTag-PP7系统，研究人员发现HuR促进含ARE/URE的炎性因子mRNA在ER上的翻译，且该调控不依赖于mRNA稳定性。第二，HuR与ER质量控制蛋白CANX的细胞质C端相互作用。通过蛋白质组学、Co-IP、PLA、pull-down、BLI、APEX2和ddFP等多种方法，证实HuR直接结合CANX的C端胞质结构域，且炎性刺激增强该相互作用。第三，HuR通过调节CANX功能调控炎性细胞因子分泌。CANX敲低抑制炎性因子分泌，HuR敲低减弱CANX与TRAPα及炎性因子的结合，HuR回补可恢复该相互作用。第四，HuR与炎性因子mRNA共定位于ER表面。FPP实验、亚细胞分级和蛋白酶保护实验证实HuR通过CANX锚定于ER表面，RNA-FISH显示HuR与TNFα mRNA在ER上呈颗粒状共定位，RNase处理减弱HuR-CANX相互作用。第五，HuR通过相分离形成富集炎性因子mRNA的RNA颗粒。体外和细胞内实验证实HuR发生LLPS，RNA促进其相分离，内源性炎性因子mRNA与HuR和CANX共定位于胞质颗粒中，且这些颗粒不同于经典应激颗粒。第六，HuR的RRM1和RRM2结构域介导其细胞内相分离。截短突变体分析表明RRM1（RNA结合）和RRM2（内含内在无序区）协同介导LLPS，相分离能力与CANX-TRAPα相互作用及炎性因子分泌密切相关。第七，CANX-C3肽段阻断HuR-CANX相互作用并减轻小鼠肺部炎症。TAT-CANX-C3肽段抑制HuR-CANX结合、ER上HuR颗粒组装及CANX与TRAPα和TNFα的相互作用，减少炎性因子表达和分泌，并在LPS诱导的小鼠急性肺炎模型中减轻肺部炎症和中性粒细胞浸润。
讨论部分总结：本研究揭示了HuR不仅作为经典的mRNA稳定因子，还作为炎性细胞因子分泌途径的关键空间组织者，通过偶联ER依赖的翻译与蛋白质质量控制过程发挥作用。炎性刺激下，细胞质HuR直接与ER伴侣蛋白CANX相互作用，通过LLPS在ER膜上形成无膜RNA颗粒，将炎性mRNA、易位子机器和CANX质量控制复合物浓缩于离散的ER亚结构域中，实现新生多肽合成与折叠监视的即时偶联。该发现将HuR的功能从经典mRNA稳定因子扩展为ER依赖的翻译和翻译后调控的核心协调者。研究还指出其他炎性因子如IL-1β和IL-18主要通过非ER依赖途径合成和成熟，HuR是否通过3‘UTR调控其细胞质折叠值得进一步研究。此外，虽然本研究未检测到HuR与TIS11B或TIA1的直接相互作用，但其他RBPs可能协同调控ER膜上HuR阳性颗粒的形成。CANX的功能受多种翻译后修饰和细胞质蛋白相互作用调控，HuR-CANX特异性相互作用为过度炎性反应或HuR异常激活驱动的疾病提供了有前景的治疗靶点。TAT-CANX-C3肽段特异性阻断HuR-CANX相互作用而不影响HuR的mRNA结合能力或核质穿梭，避免了全局抑制HuR的潜在副作用。未来应评估TAT-CANX-C3在慢性炎性疾病和HuR异常肿瘤中的治疗效力，并优化其递送策略。研究结论翻译：总之，本研究证明在免疫应答中，当机体迫切需要建立有效的免疫防御并实现炎性因子的高水平表达时，细胞可通过RNA结合蛋白HuR将炎性因子mRNA特异性锚定至内质网，HuR进一步与这些mRNA组装形成HuR依赖的炎性因子RNA颗粒。这些颗粒与内质网形成动态分子互作网络，加速炎性因子的质量控制、加工和分泌，最终实现炎性因子合成速率与内质网加工能力的精确协调。这一精细的调控范式揭示了细胞在应激条件下平衡免疫防御效率与ER稳态的核心策略，为理解先天免疫应答的快速启动机制提供了新的分子视角，同时阐明了HuR介导的炎性因子翻译调控新途径，更为重要的是为过度炎性反应驱动疾病的治疗开发提供了关键分子靶点和理论基础。
