DNA胞嘧啶修饰，包括5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，是调节并维持细胞类型特异性转录程序的基本表观遗传标记。单细胞和空间甲基化组分析的最新进展已能够表征跨细胞群体和发育背景的表观遗传异质性。然而，现有的甲基化组分析策略缺乏在组织微环境中同时捕获5mC和5hmC景观所需的空间分辨率。第三代测序技术，特别是Oxford Nanopore测序，无需亚硫酸氢盐或酶法转化即可直接检测5mC和5hmC。该方法保留了DNA完整性，避免了聚合酶链式反应(PCR)引入的扩增偏差，并产生支持单倍型分辨率表观基因组分析的长读长。在此，研究人员开发了空间DNA引导的单分子甲基化组与高通量转录组测序技术(Spatial DNA-Directed Single-Molecule Methylome & High-Throughput Transcriptome Sequencing, Spatial-DiSMHT-seq)，这是一种空间多组学技术，能够在完整组织中联合分析天然5mC和5hmC景观及转录组。
研究背景与目的
DNA胞嘧啶修饰，包括5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，是调控和维持细胞类型特异性转录程序的基本表观遗传标记。近年来，单细胞和空间甲基化组分析技术取得进展，使研究者能够表征细胞群体和发育背景下的表观遗传异质性。然而，现有甲基化组分析策略缺乏在组织微环境中同时捕获5mC和5hmC景观所需的空间分辨率。第三代测序技术，尤其是Oxford Nanopore测序，无需亚硫酸氢盐或酶法转化即可直接检测DNA上的5mC和5hmC，同时保留DNA完整性、避免聚合酶链式反应(PCR)引入的扩增偏差，并产生支持单倍型解析表观基因组分析的长读长。基于这些优势，研究人员开发了空间DNA引导的单分子甲基化组与高通量转录组测序技术(Spatial-DiSMHT-seq)，旨在完整组织内联合分析天然5mC和5hmC景观及转录组。
研究内容与总体结论
研究人员将Spatial-DiSMHT-seq应用于成年小鼠睾丸、胚胎第9.5天(E9.5)小鼠胚胎和Carnegie分期15–16(CS15–16)人类胚胎组织切片，空间分辨率为10或20μm。通过正交方法验证，该技术能够可靠、定量地检测5mC和5hmC，并同时恢复空间转录组。该技术揭示了多种组织中与细胞类型和发育进程相关的DNA修饰动态，包括减数分裂重编程、胚胎器官发生中的局部低甲基化状态，以及神经分化中的5mC/5hmC变化。这些结果确立了该方法作为空间表观多组学平台的可行性。
关键技术方法
Spatial-DiSMHT-seq整合微流控空间条形码与无PCR的Oxford Nanopore测序。具体流程包括：固定冷冻组织切片，利用Tn5转座酶标记基因组DNA(gDNA)，原位捕获多聚腺苷酸化RNA并进行逆转录；基于DBiT-seq(deterministic barcoding in tissue-seq)策略，将gDNA片段和互补DNA(cDNA)依次连接空间条形码A和B；随后连接Nanopore文库接头并解除交联；利用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的cDNA用于高通量测序，而含gDNA的上清液用于Oxford Nanopore无PCR长读长测序。样本来源包括成年小鼠睾丸、E9.5小鼠胚胎和CS15–16人类胚胎。
研究结果
技术验证与数据质量：Nanopore读段平均Phred质量分为17–22，每像素中位唯一读段数为113–452，读长中位数为533–972 bp。每个像素覆盖约496–2272个CpG位点，88.4%–93.7%的比读段携带可检测的DNA修饰信号。5mC测量与传统全基因组重亚硫酸盐测序结果高度相关(Pearson’s r=0.866)；5hmC测量与酶法5hmC-seq及人类胎儿脑氧化亚硫酸盐数据中等一致(r=0.54和0.53)。同时恢复的空间转录组每像素中位基因数为4400–5623，重复切片间转录组和5mC水平高度一致。
成年小鼠睾丸中的DNA甲基化重编程：在成年小鼠睾丸中，RNA定义聚类识别了10个富集不同细胞类型的空间簇，其空间分布与已知组织学分区一致。该方法重现了减数分裂起始时全基因组DNA去甲基化波，并恢复了减数分裂重组热点及转座子上预期的修饰模式，表明其能够捕获生物学上有意义的DNA甲基化动态。
小鼠胚胎发育中的空间表观遗传动态：在E9.5小鼠胚胎中，研究识别了14个对应解剖结构的RNA定义空间簇。在已注释的组织特异性增强子集合中，活性增强子区域呈现5mC降低和5hmC升高。背主动脉富集点呈现独特的低5mC/低5hmC状态，且这些点位高表达增殖相关基因Mki67、G2/M期比例较高，而从头甲基转移酶Dnmt3a/3b和TET双加氧酶表达较低，提示有限的从头甲基化、TET介导的5mC氧化减少及复制耦合被动稀释可能共同导致该表观状态。
人类胚胎中的空间修饰模式：在CS15–16人类胚胎中，研究识别了18个空间簇。候选5mC差异甲基化区域和5hmC高区域与心肌细胞、肝母细胞等组织身份紧密对应。肝母细胞富集区域整体5mC和5hmC水平降低，伴随低从头甲基转移酶和TET表达及高增殖基因表达。在发育肢体内，血管丛富集点相比软骨祖细胞富集点具有更低的甲基转移酶/TET表达和更低的5mC/5hmC水平，表明空间上相邻但命运不同的细胞群存在不同表观格局。
后脑神经分化中的DNA修饰动态：沿着从放射状胶质细胞到未成熟神经元的分化轨迹，5mC水平逐渐降低，而5hmC水平同步升高。神经元身份相关基因基因体上的5mC/5hmC动态与全局趋势一致，而放射状胶质相关基因不完全符合此模式。维持甲基化相关基因在放射状胶质细胞中高表达，未成熟神经元中从头甲基转移酶和TET双加氧酶表达较高，提示神经元分化过程中存在活跃的表观遗传重塑。
讨论
Spatial-DiSMHT-seq作为直接的空间共分析平台，能够在单分子水平区分5mC和5hmC，并避免PCR相关偏差，从而为空间表观基因组提供独特视角。然而，与现有的单细胞和空间甲基化组方法相比，其无PCR设计导致每像素CpG覆盖稀疏，对小型调控元件和稀有细胞群的敏感度有限；像素层面的细胞混合可能掩盖细胞类型特异性差异；此外，5hmC的定量可重复性低于5mC，因此对适度定量差异或局部基因组特征的分析应谨慎解读。增加测序深度、生物学重复、区域聚合和正交验证有望进一步提高灵敏度与定量精度。
研究结论
总而言之，这些发现确立了Spatial-DiSMHT-seq作为一种直接的空间共分析平台，能够联合分析天然5mC和5hmC景观及转录组。该技术直接区分单分子水平上的5mC与5hmC，同时避免PCR相关偏差，为空间表观基因组提供了独特视角。这一能力有望推进我们对发育、稳态和疾病中表观遗传景观的理解。
