引言
外泌体是由所有类型的免疫和非免疫细胞分泌的磷脂双分子层囊泡，直径在30-150纳米之间，介导细胞间的物质交换。它们是小型细胞外囊泡的一部分，在多泡体内形成，并通过多泡体与质膜融合而分泌。源自多泡体的sEV含有代表亲代细胞的各种蛋白质、脂质和核酸，其内容物反映了细胞内选择性分选过程。sEV被靶细胞摄取后可诱导特定的生物学功能，这取决于其携带并转移至受体细胞的组分。正常细胞分泌的sEV在组织完整性和免疫监视中发挥有益作用，而肿瘤细胞组成性分泌的sEV则有助于促进肿瘤进展、侵袭性和免疫抑制。这些发现凸显了通过药理学控制肿瘤sEV内容物以刺激抗肿瘤免疫的治疗相关性。先前的研究表明，树突状素A可以实现这一目标。DDA是一种内源性胆固醇代谢物，是肝X受体α和β的调节剂。LXR是核受体和配体依赖性转录因子，调节脂质代谢和免疫。在黑色素瘤和乳腺癌细胞中，DDA/LXRβ复合物增加了富含外泌体的sEV的分泌，这些sEV被称为DDA-sEV，并与肿瘤细胞和DDA-sEV中磷脂双(单酰甘油)磷酸水平的升高相关。DDA-sEV在免疫健全小鼠中显著抑制肿瘤生长，并促进人树突状细胞的成熟，从而在体外激活Th1 T细胞极化。
BMP是一种对内体晚期和溶酶体特异的磷脂，在脂质降解中起关键作用，调节内体胆固醇的命运，并有助于腔内囊泡的形成。BMP生物合成的失调与多种疾病相关。最近的重要进展发现，BMP可以由存在于髓系细胞表面的内皮蛋白C受体呈递，并且参与BMP生物合成的酶包括CLN5以及磷脂酶D3/4。此外，溶酶体PLA2G15被证明可以产生BMP的前体LPG，或水解某些BMP异构体。
结果
BMP富集的DDA-sEV展现抗肿瘤免疫反应并延长小鼠生存期
研究首先分析了DDA对小鼠B16K1黑色素瘤和4T1三阴性乳腺癌细胞中BMP积累的影响，并评估了DDA-sEV诱导小鼠抗肿瘤免疫反应的能力。使用免疫荧光和液相色谱/质谱联用技术证实，DDA在不诱导细胞死亡的浓度下，能显著增加BMP免疫染色强度和BMP水平，并促进DDA-sEV的分泌。对sEV内容的分析显示，来自B16K1和4T1细胞的DDA-sEV含有更高水平的BMP和自噬标记LC3-II，但外泌体标志物CD63、PD-L1、Alix或HSP70水平无差异。此外，DDA-sEV并未富集黑色素细胞抗原或乳腺抗原。在免疫健全小鼠模型中，注射从DDA处理的肿瘤细胞分泌的DDA-sEV能显著抑制B16K1和4T1肿瘤的生长，并延长小鼠的生存期。在B16K1模型中存活的小鼠再次接种亲代肿瘤细胞后未发生肿瘤，表明其产生了免疫记忆。这些数据表明，源自黑色素瘤或TNBC细胞的DDA-sEV具有抗肿瘤活性，能延长小鼠生存期，并可能诱导长期保护性抗肿瘤免疫反应。
DDA-sEV促进免疫细胞浸润至移植瘤内
进一步分析显示，与对照组相比，DDA-sEV处理的小鼠肿瘤体积更小。免疫组织化学和流式细胞术分析表明，DDA-sEV处理的肿瘤中CD3+、CD4+、CD8+T细胞和CD11c+髓系细胞浸润显著增加。流式细胞术分析显示，DDA-sEV处理的肿瘤中活化的CD4+和CD8+T细胞以及成熟的DC显著增加。DDA-sEV还显著增加了肿瘤中cDC1+和cDC2+亚群的积累，并在肿瘤引流淋巴结中增加了cDC2的积累。在4T1肿瘤模型中也观察到类似的结果，DDA-sEV处理降低了肿瘤重量，并增加了肿瘤内活化CD8+T细胞和成熟DC的积累。为了确定DDA-sEV的抗肿瘤免疫反应是否源于对肿瘤植入的干扰，研究在肿瘤建立后进行治疗。结果表明，DDA-sEV治疗仍能显著抑制肿瘤生长，并增加肿瘤内活化T细胞和DC的积累，支持其免疫介导的机制。
BMP/EPCR复合物参与iDC对DDA-sEV的摄取及iDC成熟
接下来评估了DDA-sEV或C-sEV被小鼠骨髓来源的未成熟DC的摄取及其对iDC成熟的影响。使用CFSE标记sEV的实验表明，与CFSE-C-sEV相比，CFSE-DDA-sEV在37°C下被iDC摄取的效率和速度更高，且该过程是能量依赖的内吞作用而非表面吸附。免疫荧光分析证实sEV被靶向细胞内区室。DDA-sEV处理的iDC其表面MHC-II、CD80、CD86和CCR7的表达显著上调，并伴随IL12b和TNFα mRNA表达的增加，表型和功能均发生成熟。使用特异性抗BMP抗体阻断DDA-sEV上的BMP后，其被iDC的摄取以及诱导iDC成熟的能力均受到显著抑制。同样，在iDC上阻断BMP呈递受体EPCR，也抑制了DDA-sEV的摄取和DC成熟。用游离BMP直接处理iDC可诱导其功能性成熟，而对照磷脂PC则无此作用，证实BMP本身即是关键的免疫激活剂。
DDA-sEV成熟的DC激活CD4+T细胞且BMP阻断抑制此过程
功能分析显示，经DDA-sEV成熟的DC在混合反应实验中能显著激活CD4+T-bet+IFNγ+Th1细胞，但其对CD8+IFNγ+T细胞的激活作用不明显。使用抗BMP抗体阻断DDA-sEV上的BMP后，其激活CD4+T细胞的能力被废除，表明BMP在DDA-sEV诱导的Th1 CD4+T细胞反应中至关重要。
DDA/LXRβ复合物激活肿瘤细胞中参与BMP生物合成的酶
研究表明，DDA通过LXRβ显著上调B16K1和SKMEL28细胞中CLN5、PLD1、PLD3和PLA2G15的mRNA水平，而这些酶的启动子区域存在典型的LXR结合基序。利用1-丁醇（抑制PLD转磷脂酰基活性）或PLD1抑制剂VU0359595处理细胞，可显著降低DDA诱导的BMP水平升高和sEV分泌，而叔丁醇无影响。脂质组学分析进一步证实DDA处理增加了PLD的底物PC、产物PA及其去磷酸化产物DAG的水平，同时增加了LPG和多种BMP物种的水平。在表达LXRβ的细胞中，DDA能增加LPG和BMP的生物合成，而在LXRβ缺陷的细胞中则无此作用。
降低DDA-sEV中的BMP水平抑制其抗肿瘤免疫功能
在体内实验中，与DDA-sEV相比，从用PLD抑制剂处理的肿瘤细胞中分离的PLD inh-DDA-sEV（BMP水平降低）失去了抑制B16K1肿瘤生长和促进肿瘤内活化CD8+T细胞积累的能力，表明DDA-sEV的抗肿瘤活性依赖于PLD介导的BMP富集。
阻断DDA-sEV上的BMP阻止其抗肿瘤免疫原性
使用抗BMP抗体阻断DDA-sEV上的BMP后，其在体内抑制肿瘤生长、促进T细胞和DC肿瘤浸润、以及提高小鼠生存率的能力均被废除。而阻断CD63或PD-L1则不影响DDA-sEV的抗肿瘤效果。在4T1肿瘤模型中也观察到类似结果，BMP阻断消除了DDA-sEV的抗肿瘤免疫原性。
DDA-sEV增强抗PD-1对黑色素瘤的疗效
DDA-sEV预处理能显著增强抗PD-1疗法对B16K1黑色素瘤的疗效，联合治疗组小鼠的肿瘤生长抑制和生存期延长均优于单药治疗。而使用抗BMP抗体阻断DDA-sEV上的BMP后，其与抗PD-1的协同效应消失，小鼠生存率显著降低。这表明DDA-sEV中的BMP富集对于增强抗PD-1疗效至关重要。
讨论
本研究阐明了增加肿瘤sEV中BMP水平对于刺激抗肿瘤免疫反应和增强抗PD-1疗法疗效的重要性。DDA/LXRβ复合物通过转录激活CLN5、PLD1、PLD3和PLA2G15等酶，刺激了肿瘤细胞中BMP的生物合成及其在DDA-sEV中的富集。BMP是DDA-sEV抗肿瘤免疫原性的关键决定因素，它通过与其呈递受体EPCR相互作用，促进iDC对sEV的摄取和功能成熟，进而驱动Th1型CD4+T细胞反应。降低或阻断DDA-sEV中的BMP会削弱其抗肿瘤免疫活性。此外，研究发现黑色素瘤和乳腺癌肿瘤组织中CLN5和PLD1的表达下调，且低CLN5表达与黑色素瘤患者对抗PD-1治疗无反应相关。因此，诱导BMP生物合成可能是一种有前景的癌症免疫治疗策略，BMP及其生物合成酶或可作为抗PD-1治疗反应的生物标志物。
