2.1 老年NK细胞对衰老成纤维细胞的细胞毒性降低
研究表明，老年个体（平均70岁）和老年小鼠（平均700天）的NK细胞对衰老人真皮成纤维细胞（HDF）的清除能力显著降低。通过钙黄绿素AM染色和流式细胞术分析发现，老年NK细胞对复制性衰老、多柔比星诱导衰老、电离辐射诱导衰老以及老年个体来源的衰老HDF的杀伤效率均低于年轻NK细胞。实时成像显示老年NK细胞与靶细胞结合不稳定、移动缓慢，且对慢性淋巴细胞白血病细胞系（K562、HG3、OSU-CLL、JVM2）的杀伤能力也显著下降。老年小鼠脾脏和骨髓来源的NK细胞同样存在类似功能缺陷，表明NK细胞毒性随年龄衰退具有跨物种普遍性。
2.2 老年个体NK细胞与衰老人真皮成纤维细胞和白血病细胞的结合减少
进一步研究发现，老年NK细胞与衰老HDF的结合频率显著降低（最高结合频率5.4% vs 年轻组37%）。尽管衰老HDF表面MHC-I类分子（HLA-1）表达下降（应促进NK细胞杀伤），且应激配体MICA/B表达上调，但老年NK细胞表面激活受体NKG2D/CD314表达量无显著变化。这表明老年NK细胞功能缺陷并非源于经典受体-配体识别障碍，而是与免疫突触形成环节的微观机制异常相关。
2.3 老年个体NK细胞穿孔素和颗粒酶B的脱颗粒减少
通过CD107a脱颗粒检测发现，老年NK细胞脱颗粒能力显著减弱。Western blot和流式细胞术显示老年NK细胞内穿孔素和颗粒酶B含量降低，与衰老HDF共培养后颗粒酶B释放量减少。微管网络紊乱导致细胞毒性颗粒向免疫突触运输受阻，可能是脱颗粒缺陷的核心机制。
2.4 老年个体NK细胞的整体转录组和通路改变
转录组分析显示，老年NK细胞中组胺受体信号、干扰素-α信号、p53信号等通路上调，而白细胞介素信号、MAPK信号、膜运输/囊泡介导运输等通路下调。差异基因富集分析提示微管运输、脱颗粒过程和线粒体能量代谢相关基因表达受损，与功能学结果相互印证。
2.5 CASIN重新平衡老年个体NK细胞中过度活跃的Cdc42活性
老年NK细胞中Cdc42表达及其GTP结合形式（活性态）显著升高。小分子抑制剂CASIN处理可降低Cdc42活性至年轻水平，并恢复微管蛋白和Cdc42的极性分布。免疫荧光显示CASIN能逆转老年NK细胞中Cdc42和微管的弥散分布，重建细胞极性。
2.6 CASIN改善老年个体NK细胞的结合、囊泡融合和线粒体功能
CASIN处理显著提升老年NK细胞与衰老HDF的结合效率和脱颗粒能力。Seahorse能量代谢分析表明老年NK细胞ATP产量下降，JC-1染色显示线粒体膜电位降低，而CASIN处理可逆转这些异常。证明Cdc42过度活化通过破坏微管-线粒体轴导致能量危机，进而削弱细胞毒性功能。
2.7 CASIN治疗提高老年人和小鼠NK细胞的杀伤能力
体外实验中，CASIN处理的老年NK细胞对衰老HDF和K562白血病细胞的杀伤能力恢复至年轻水平。体内实验显示，CASIN腹腔注射可 rejuvenate 老年小鼠NK细胞对衰老鼠真皮成纤维细胞（MDF）和YAC-1淋巴瘤细胞的清除能力。皮肤免疫荧光染色证实CASIN不影响NK细胞组织驻留数量，主要通过功能调控发挥作用。
3 讨论
本研究首次阐明Cdc42过度活化是老年NK细胞功能衰退的核心机制。其通过破坏微管网络-线粒体功能轴，导致细胞极性丧失、毒性颗粒释放障碍和能量代谢缺陷。CASIN通过精准调控Cdc42活性，逆转年龄相关的NK细胞功能衰退，为治疗衰老相关疾病（如组织纤维化、血液恶性肿瘤）提供了新靶点。组胺信号通路上调与Cdc42活性异常的关联、TEC激酶表达下降的调控机制等科学问题仍需深入探索。
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