年轻多能干细胞分泌组谱分析揭示支持老年神经肌肉健康的血管生成与免疫调节机制
1 引言
衰老是影响运动和认知功能的众多神经肌肉（Neuromuscular, NM）疾病的主要风险因素。细胞间通讯改变是衰老的九大标志之一。在正常情况下，促进组织再生的细胞间信号是由驻留的祖细胞释放的分泌分子。然而，随着年龄增长，组织稳态衰退，导致与血管生成和炎症相关的关键信号通路失调。衰老的肌肉表现出血管化显著减少和形成新血管的内源性能力受损。同样，衰老大脑中血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的破坏，包括内皮细胞体积减少、周细胞和星形胶质细胞连接减弱以及血液更替受损，损害了调节健康血管环境的能力。此外，免疫信号调节也会随着年龄增长而受损。
异时异种共生（heterochronic parabiosis）等实验表明，年轻小鼠的全身性因子可以促进老年小鼠的肌肉再生，但其潜在机制尚不清楚。我们之前的研究发现，将年轻肌肉来源干/祖细胞（Muscle-Derived Stem/Progenitor Cells, MDSPCs）系统移植到早衰症小鼠模型中，可显著延长其健康寿命和寿命。重要的是，从早衰症或自然衰老小鼠中分离的“衰老”MDSPCs则没有这些效果。我们还在体外共培养系统中证明，年轻MDSPCs通过分泌因子在功能上挽救了衰老MDSPCs的内在缺陷。值得注意的是，在这些实验的任何阶段，供体细胞都未在被“年轻化”的神经肌肉骨骼组织中发现，表明年轻MDSPCs通过分泌因子发挥作用，但其具体机制尚不明确。
本研究旨在验证一个假说：与衰老MDSPCs相比，年轻MDSPCs差异性分泌的蛋白质富含促进衰老神经肌肉组织再生的因子。我们使用抗体阵列量化了年轻和衰老MDSPCs的分泌蛋白，并分析了接受年轻MDSPCs系统性移植的自然衰老小鼠的神经肌肉组织，以研究与这些因子相关的通路。结果表明，MDSPCs通过分泌因子调节血管生成和免疫信号通路，这些通路与系统注射后观察到的功能和病理组织学改善直接相关。
2 结果
2.1 年轻MDSPCs分泌促血管生成和免疫调节因子
为了确定年轻MDSPCs分泌的蛋白质及其最可能影响的分子机制，我们比较了年轻和衰老（2岁）MDSPCs的分泌组。在测试的640种细胞因子和生长因子中，有499种蛋白在至少一个样本中可检测到，281种在实验样本中的水平高于培养基对照。通过假发现率（False Discovery Rate, FDR）分析，两组之间有13种因子的分泌量存在显著差异（q值 ≤ 0.05）。
火山图分析显示，13种显著差异因子中，有12种在年轻MDSPCs分泌组中表达上调超过2倍。这些因子包括：半乳糖凝集素-9（Galectin-9, LGALS9）、乳脂肪球表皮生长因子8（Milk Fat Globule-EGF Factor 8, MFGE8，又称乳黏着蛋白）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4, CTLA4）、血小板衍生生长因子A亚基（Platelet-Derived Growth Factor Subunit A, PDGFA）、趋化因子配体9（Chemokine Ligand 9, CCL9，又称MIP1γ）、肿瘤坏死因子受体超家族成员19（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 19, TNFRSF19，又称TROY）、组织蛋白酶L（Cathepsin L, CTSL）、胎盘生长因子（Placental Growth Factor, PGF）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）、E1A刺激基因1的细胞反应（Cellular Response of E1A-Stimulated Genes 1, CREG1）、膜金属内肽酶（Membrane Metalloendopeptidase, MME，又称脑啡肽酶）和基质细胞衍生因子1（C-X-C Motif Chemokine Ligand 12, CXCL12，又称SDF1）。唯一在衰老MDSPCs中显著升高的因子是骨桥蛋白（Osteopontin, SPP1，又称OPN），但其表达未超过2倍。
对年轻MDSPCs高表达的12种因子进行功能注释和富集分析，超过250个基因本体（Gene Ontology, GO）术语显著富集，主要类别包括蛋白质调节、新生血管形成、组织发育和再生、细胞信号传导和免疫调节。年轻MDSPCs的分泌组谱分析揭示了一个富含血管生成和免疫调节因子的蛋白质组学特征。
2.2 年轻MDSPCs的系统移植改善自然衰老小鼠的运动功能
自然衰老小鼠在22月龄时腹腔注射年轻MDSPCs（细胞注射组，NA-CI）或PBS作为对照（NA-PBS）。移植后1个月进行功能评估，移植后2个月处死并收集组织。
开放场地测试评估显示，与NA-PBS小鼠相比，NA-CI小鼠的自发运动显著增加，平均移动速度和总移动距离更高。行为学分析表明，NA-CI小鼠在测试区中心区域静止不动的时间以及在中心区域的总时间均显著多于NA-PBS小鼠，而在外围区域的时间则更少，提示MDSPC移植小鼠的焦虑样行为减少。
2.3 年轻MDSPCs的系统移植增强衰老骨骼肌新生血管化并调节血管完整性通路
移植后2个月（24月龄）处死小鼠。基于分泌组通路分析，我们研究了年轻MDSPCs移植后对肌肉和脑组织新生血管形成的潜在影响。腓肠肌（Gastrocnemius, GS）切片免疫荧光染色显示，与NA-PBS小鼠相比，NA-CI小鼠的GS肌肉中每个肌纤维周围的CD31+血管数量及血管占据的肌肉面积百分比均显著增加，表明肌肉血管密度更高。
为了深入理解相关通路激活机制，我们对NA-CI和NA-PBS小鼠的GS肌肉进行了血管生成通路关键蛋白位点的磷酸化抗体阵列分析。结果显示，在NA-CI肌肉中，已知在新生血管化通路中发挥作用的蛋白位点ELK1Ser389、MEK2Thr394和AKTThr308的磷酸化水平显著更高。相反，与通路作用冲突或定义不明确的FAKTyr576和FAKSer910位点的磷酸化则在NA-PBS肌肉中显著更高。已知支持新生血管化的蛋白位点磷酸化水平升高，为年轻MDSPCs如何传递治疗益处提供了机制性见解。
2.4 年轻MDSPCs的系统移植改善衰老肌肉结构和线粒体功能
损伤或疾病引起的炎症会导致骨骼肌纤维化增加。天狼星红/固绿染色分析显示，与NA-CI小鼠相比，NA-PBS小鼠GS肌肉的胶原（红色）面积百分比显著更高，表明细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）纤维化更严重。
肌肉功能改善的潜在机制研究显示，NA-CI和NA-PBS小鼠的GS肌纤维横截面积（Cross-Sectional Area, CSA）分布存在统计学差异。NA-CI肌纤维更大，面积分布向大尺寸偏移。同时，NA-CI小鼠股四头肌的柠檬酸合酶（Citrate Synthase）活性显著高于NA-PBS小鼠，表明线粒体含量和能量产生更高。此外，GS肌肉的肌纤维类型分析表明，NA-CI小鼠中富含线粒体的抗疲劳型IIa肌纤维比例显著增加，而以牺牲快易疲劳型IIb肌纤维为代价。这些结果表明，年轻MDSPC治疗部分通过改善肌肉组织病理学和线粒体含量来增强肌肉功能。
2.5 年轻MDSPCs的系统移植增加衰老运动皮层的新生血管化并增强血脑屏障完整性
为评估年轻MDSPCs系统移植是否增加了运动皮层的新生血管化并改善了BBB完整性，我们量化了CD31+血管和GFAP+星形胶质细胞。根据与白质束的接近程度，运动皮层被细分为两个不同的区域：浅层（Superficial, Sf；皮质2/3层和5层）和深层（Deep, Dp；皮质6a层和6b层）。
分析显示，在NA-CI小鼠的浅层运动皮层中，CD31+血管的面积百分比有增加趋势。更重要的是，在所有皮层区域，NA-CI小鼠个体血管的中位尺寸均显著大于NA-PBS小鼠，表明血管化增强。虽然星形胶质细胞的总面积百分比没有差异，但NA-CI小鼠浅层皮层星形胶质细胞的中位尺寸显著更大。此外，作为神经血管单元完整性的一个指标，GFAP+星形胶质细胞与CD31+血管的共定位面积百分比在NA-CI小鼠浅层皮层中有升高趋势，且其中位共定位尺寸显著更大。这些发现表明，系统性给予年轻MDSPCs增强了皮层新生血管化，并可能通过分泌旁分泌促血管生成因子，有助于BBB的恢复。
3 讨论
这是首个全面揭示年轻多能成年MDSPCs分泌因子并阐明其系统性年轻化神经肌肉组织能力的机制研究。鉴于MDSPCs的治疗作用已被证明主要由其分泌的旁分泌因子介导，我们旨在通过多重抗体阵列阐明年轻MDSPCs分泌组的组成。我们发现年轻MDSPCs具有独特的分泌蛋白质组。计算通路分析预测，这些分泌蛋白调节许多与血管生成和免疫调节相关的进程。尤其是与“血管发育”等显著促血管生成GO术语相关的因子，包括PGF、CXCL12、MFGE8、PDGFA和TNF。同样，与“白细胞分化调节”等免疫调节GO术语最相关的因子是CTLA4、CCL9、LGALS9和TNF。值得注意的是，肿瘤坏死因子（TNF）通常与炎症和细胞凋亡相关，但在此背景下，其可能通过非经典NF-κB信号通路（RelB/p52）而非经典的促炎p65/p50通路发挥作用，从而促进免疫耐受和细胞存活——这两种关键功能在衰老过程中经常受损。
有趣的是，虽然衰老MDSPCs分泌组中没有因子相对于年轻组上调超过2倍，但骨桥蛋白（Osteopontin, OPN）即使在1.4倍的增加下也具有统计学上的更高水平。OPN已被证明是一种促炎性的衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）因子，是纤维化和心肌衰老的驱动因素。
在结构上，接受年轻MDSPCs治疗的小鼠的肌肉血管网络显著增加。强大的血管网络对于向代谢活跃的肌纤维供应氧气和营养物质至关重要。这种血管依赖性机制可能至少部分地解释了在接受年轻MDSPCs治疗的小鼠股四头肌中观察到的更高柠檬酸合酶活性。
结合组织学结果，对血管生成机制的进一步研究揭示，MDSPCs移植小鼠肌肉中两个关键的血管生成相关蛋白位点（ELK1Ser389和AKTThr308）的磷酸化显著升高。相反，在衰老对照小鼠肌肉中磷酸化增加的两个蛋白位点（FAKTyr576和FAKSer910）则与动脉粥样硬化、内皮细胞运动性或成纤维细胞增殖相关。在后期时间点未检测到供体细胞，支持了MDSPCs的作用机制不依赖于持续植入，而与旁分泌或全身性效应一致。因此，我们提出年轻MDSPCs可能通过分泌促血管生成因子，激活已知的新生血管化通路，导致毛细血管密度增加，从而更好地支持肌肉生长和健康，促进衰老骨骼肌的功能性年轻化。
MDSPCs治疗的自然衰老小鼠在开放场地测试中表现出更强的自主运动性和与焦虑水平降低相关的行为。这些功能和行为改善，可能也与年轻MDSPCs系统移植后运动皮层血管生成增强和血管完整性改善有关。尽管MDSPCs不穿过BBB，但它们已被证明能刺激大脑血管生成。在这项研究中，接受年轻MDSPCs系统移植的自然衰老小鼠表现出个体血管尺寸增大。浅层皮层中BBB完整性的改善表明，增强对位于第5层的皮质脊髓投射神经元的血管支持，可能对改善老年小鼠的运动功能至关重要。
总之，我们的研究结果证明了系统性移植年轻MDSPCs在分子、组织学和功能水平上对衰老肌肉和大脑的年轻化作用。虽然这项研究使用的多重抗体阵列可量化超过600种已知的循环蛋白，为年轻MDSPCs的分泌组提供了重要见解，但它可能无法捕获所有的年轻化因子，包括非蛋白质介质或阵列上未包含的蛋白质。此外，年轻化效应很可能由已识别和未识别的因子组合介导，其中一些甚至可能由衰老MDSPCs分泌，这限制了差异分析锁定所有介质的能力。
我们未来的研究将验证这些已识别蛋白质在神经肌肉骨骼组织年轻化中的直接功能作用。一个可能的转化应用是测试这些已识别的促年轻化因子，或调节其分子通路的现有药物，作为组合疗法。其中一些因子，如用于治疗类风湿关节炎的CTLA4，已被临床批准，但尚未作为抗衰老药物进行测试。基于这些发现，未来的工作将开发促进神经肌肉骨骼健康和年轻化的疗法。
