1 引言
生物节律与昼夜周期高度同步，主要由一个受环境牵引的分子生物钟控制，使生物体能够通过节律性基因表达程序来预测和应对可预测的昼夜循环。衰老过程中，昼夜节律行为和基因表达都会发生变化，这在许多年龄相关疾病模型中也有体现。破坏昼夜节律与多种人类健康状况相关，包括神经退行性疾病、癌症和心理障碍。在分子水平上，生物钟由一个高度保守的转录-翻译反馈环构成。生物体各组织间的时钟通讯对机体健康至关重要，而这种通讯的退化在衰老生物体中观察到，其背后是不同组织中分子时钟发生的一系列复杂变化。
视网膜对于视觉感知光和向大脑传递时间信息以同步全身节律至关重要。操纵分子时钟破坏昼夜节律会导致果蝇和小鼠视网膜提前退化，并且在年龄相关性眼病模型中基因表达的节律也会改变。尽管如此，视网膜基因表达节律为何以及如何随年龄改变仍不清楚。
表现遗传改变，包括染色质可及性和组蛋白修饰的变化，是衰老的一个标志，有助于解释年龄相关的基因表达变化。生物钟建立的转录因子网络与包括组蛋白修饰在内的表现遗传标记协调作用，以建立节律性基因表达。在衰老的视网膜中，已观察到DNA甲基化、染色质可及性和组蛋白甲基化的表现遗传改变，提示这些变化可能影响节律性转录组。
2 结果
2.1 衰老重塑光感受器的节律性转录组
为探究光感受器衰老如何影响昼夜周期中的节律性基因表达，研究人员分别在年轻（D10）和年老（D50）果蝇的光感受器中进行了全天的细胞核RNA测序（RNA-seq）。主成分分析（PCA）显示，样本按一天中的时间（授时因子时间，ZT）和年龄分离，且老年果蝇中ZT的分离度降低。在统计模型拟合准确的基因中，74%的基因在其中一种或两种条件下具有节律性：28%在两个年龄段节律相同，19%失去节律性，10%获得节律性，17%的节律参数（如相位或振幅）发生改变。仅有26%的基因在两个年龄段均为非节律性，这表明在正常的日常光周期下，大多数光感受器基因是节律性表达的。基于内含子读数的分析得出了高度相似的结果，表明这些年龄依赖的节律性基因表达变化反映了转录前mRNA水平（可能即转录本身）的变化，而非稳态mRNA的变化。
核心时钟基因主要属于年龄调节节律类别，其表达振幅急剧下降，但相位没有同时改变，表明它们的表达时间仍与昼夜周期同步。此外，时钟基因在老年果蝇中表现出整体表达水平的下降。总的来说，节律性表达变化通常并不伴随总体基因表达水平的改变。在年轻果蝇中，节律性基因的表达峰值最常出现在三个时间段：ZT0-4、ZT8-12和ZT20-24。在老年果蝇中，这种三峰分布转变为双峰分布，因为ZT0-4的峰值消失了。早期早晨表达峰值的丧失表明老年果蝇对光开始的敏感性降低。
2.2 衰老改变了Pol II占有率、染色质可及性和H3K4甲基化的节律
为了解染色质结构如何促成节律性转录的改变，研究人员检测了衰老过程中RNA聚合酶II（Pol II）占有率、染色质可及性和H3K4甲基化的模式。利用CUT&RUN技术在年轻和年老的光感受器中，每4小时分别分析了H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3以及Pol II。同时，使用ATAC-seq技术检测了相同样本的染色质可及性。
在年轻果蝇中，Pol II占有率在全基因组启动子区域在ZT8和ZT20达到最大值，分别比光线开启或关闭早4小时。在这两个时间点之间，即ZT12时，启动子区域的染色质可及性达到峰值。在老年果蝇中，Pol II仍然有两个最大占有率波峰，但时间提前了4小时，变为ZT4和ZT16。最大染色质可及性同样在老年果蝇中提前了4小时，但其分布扩展到多个时间点，与D10时在ZT12受限的峰值可及性形成对比。
H3K4甲基化在年轻果蝇中也显示出动态模式，但这些变化在衰老过程中消失了。与Pol II占有率和染色质可及性的周期性振荡不同，年轻果蝇中启动子区域的H3K4me3水平在一天中的大部分时间保持高位，仅在夜间ZT16时下降一次，同时伴随H3K4me1的短暂升高。四小时后，在ZT20时，启动子H3K4me3水平回升，伴随着H3K4me1/2的下调，此时接近光照阶段开始。此外，在年老光感受器中，启动子区域的H3K4me2/3水平整体下降，同时转录起始位点的H3K4me1水平升高。这种年龄依赖的H3K4me2/3下降不太可能由Pol II招募缺陷引起，因为老年果蝇的启动子Pol II信号略有增加。总之，衰老改变了光感受器中Pol II占有率、染色质可及性和H3K4甲基化的全基因组动态模式。
2.3 H3K4甲基化模式与节律性转录的相位相对应
研究人员观察到，在全基因组范围内，Pol II占有率、染色质可及性的节律与节律性基因表达的时间之间几乎完全脱节。按基因峰值表达时间聚类显示，无论峰值表达时间如何，Pol II和染色质可及性的总体昼夜模式在所有基因中都是一致的。即使是非节律性基因，在年轻果蝇中也在ZT8和20显示出最高的Pol II占有率，在ZT12显示出最高的染色质可及性。
相反，研究人员观察到在不同时间达到峰值表达的节律性基因之间，H3K4甲基化的相对信号水平存在显著差异。在年轻和老年果蝇中，表达峰值在ZT8-16（涵盖从白天到黑夜的过渡期）的节律性基因，其H3K4me2/3水平相对于其他组的节律性基因要高得多。相反，表达峰值在一天开始（ZT0-4）的基因，其H3K4me2/3水平要低得多。对于H3K4me1，峰值在ZT8-20之间的基因水平最高，而峰值在ZT0-4之间的基因水平则低得多。在老年果蝇中，H3K4me2/3水平的这种区分得以保留，尽管幅度略有减小，但H3K4me1水平在不同组之间不再有区分。这些数据表明，许多节律性转录基因的表达相位与其H3K4甲基化的相对水平相关。
2.4 衰老光感受器中Clk:Cyc的占有率与改变的基因表达节律性不相关
为了识别衰老光感受器中Clk:Cyc结合的变化，研究人员在年轻和年老光感受器中，于两个时间点（ZT12和ZT16，相对于波谷ZT4）对GFP标记的Clk和Cyc进行了CUT&RUN分析。共鉴定出281个Clk:Cyc峰。作为对照，研究人员确认了在无标记果蝇的CUT&RUN中，这些区域没有可检测到的信号。与预期一致，在年轻和年老果蝇中，Clk:Cyc在ZT12和ZT16的富集度都高于ZT4，这与RNA-seq观察到的核心时钟基因表达相位得以维持是一致的。
研究人员没有在老年果蝇中观察到新的Clk:Cyc峰，表明Clk:Cyc在衰老过程中没有获得新的靶标。尽管在老年果蝇中没有观察到新峰，但在D50时Clk水平下降，而Cyc在两个年龄段保持相似。Clk:Cyc峰映射到136个邻近基因。与所有表达的基因相比，Clk:Cyc靶基因更常具有节律性，并且具有更高的染色质可及性、Pol II富集度，以及整个白天更显著的H3K4甲基化水平振荡。尽管Clk:Cyc靶基因往往是节律性表达的，但与所有表达的基因相比，它们在衰老过程中经历了类似的各种节律性变化。因此，D50时许多Clk:Cyc峰处Clk信号的减少并不对应于任何一种节律性改变类型，Clk:Cyc靶基因的行为与我们观察到的所有基因的总体趋势相似。基于此，数据表明Clk:Cyc转录因子占有率的变化并不能解释衰老过程中发生的大部分节律性基因表达变化。
2.5 H3K4甲基转移酶是大多数节律性基因表达所必需的
在果蝇中，存在三种H3K4甲基转移酶：SET domain containing 1 (Set1)、Trithorax (Trx)和Trithorax-related (Trr)。为了更好地理解衰老中观察到的H3K4me3下降对转录组的全面影响，研究人员通过敲低这三种甲基转移酶来降低H3K4me3水平。通过干法分析，获得了在四种敲低基因型中跨50个差异节律性模型的7763个基因。支持H3K4甲基转移酶在节律性基因表达中的关键作用，有3816个基因（49%）在至少一种敲低中失去了节律性。相比之下，只有263个基因（3%）在任何H3K4甲基转移酶敲低后保持相同的节律。值得注意的是，大多数失去节律性的基因受Trx或Trr敲低的影响，而非Set1，这表明Trx和Trr在调控节律性基因表达方面具有共享但非冗余的作用。
类似衰老数据中的观察，差异节律性表达并不对应于整体差异基因表达，但Trx和Trr调节节律类别中的基因倾向于整体表达下降。有趣的是，敲低每种HMT都会导致许多核心时钟基因（包括per、tim、vri和cwo）的基因表达振幅降低。因此，在果蝇中，所有三种H3K4甲基转移酶都是非冗余地必需的，用于维持大部分转录组的H3K4me3和节律性基因表达。此外，每一种都是核心时钟基因完全振幅表达所必需的。
2.6 衰老与H3K4甲基转移酶敲低导致许多平行的节律性基因表达变化
为了确定光感受器中H3K4me2/3甲基化的减少是否至少可以部分解释老年光感受器中节律性基因表达的广泛变化，研究人员比较了H3K4甲基转移酶敲低与衰老光感受器中观察到的节律性变化。大约83%在衰老过程中失去节律性的基因，在至少一种H3K4甲基转移酶敲低系中也失去了节律性，这主要是由于Trx或Trr敲低所致。类似地，约48%具有年龄调节节律的基因在H3K4甲基转移酶敲低后也显示出节律调节。振幅降低是衰老和敲低调节类别之间重叠基因的一个共同特征，这表明H3K4甲基化对于维持节律性基因表达的振幅很重要。事实上，许多核心分子时钟成分，如per、Cipc和cwo，在衰老和所有三种H3K4甲基转移酶敲低中表现出相似的振幅下降。值得注意的是，59%的年龄调节基因在至少一种H3K4甲基转移酶敲低中表现出节律性的完全丧失。
有趣的是，一些涉及自噬的基因在衰老和H3K4甲基转移酶敲低中都完全失去了节律。此外，参与光反应的部分基因在衰老和甲基转移酶敲低中都表现出节律性表达的改变。引人注目的是，一部分随着年龄增长获得节律性的基因在Set1敲低时也获得了节律性。除了先前描述的与氧化应激反应相关的“晚周期基因”外，这些“获得节律性”的基因编码参与翻译的蛋白质，主要是核糖体的组成部分。
2.7 多种组蛋白甲基标记在衰老光感受器中全基因组减少
先前的研究发现，老年光感受器中H3K36me3在全基因组水平也有所下降，这暗示了衰老光感受器表观基因组存在更广泛的变化。为了探究这种可能性，研究人员使用CUT&RUN技术分析了年轻（D10）和中老年（D40）光感受器中的H3K4me2/3、H3K36me3以及两种抑制性标记H3K9me3和H3K27me3。与先前的发现类似，H3K36me3在老年果蝇的基因体上减少。这些组蛋白甲基化的改变并不局限于活性标记，因为H3K9me3和H3K27me3也随着年龄增长而减少。组蛋白甲基化的减少并非源于光感受器细胞的丧失，因为这些果蝇在D40时没有表现出视网膜退化。
当研究人员检查在不同节律性变化类别的基因上每种组蛋白甲基标记的相对水平时，发现那些在衰老过程中失去或改变节律性的基因，其H3K4me2/3和H3K36me3水平相对于其他类别（非节律性、获得或保持节律性）的基因较低。此外，在衰老过程中失去节律性的基因，其H3K9me3和H3K27me3水平在D10时也相对其他类别更高。这些数据表明，随着年龄增长失去节律性的基因可能位于抑制性染色质域附近，其特征是较低的H3K4甲基化和较高的H3K27me3水平。有趣的是，这些在衰老过程中失去节律性且H3K4甲基化水平最低的基因，往往在清晨ZT0-4之间表达。研究数据表明，更广泛的染色质状态（在此部分由组合的组蛋白甲基化水平定义）既有助于年轻果蝇中昼夜节律性基因表达的相位，也有助于衰老如何改变其节律性。
3 讨论
研究数据显示，果蝇光感受器中核心时钟转录因子Clk和Cyc的占有率在年轻和年老之间没有发生重大变化。然而，在老年时期，Clk和Cyc刺激基因表达的能力发生了改变，这体现在许多靶基因节律性表达的变化上。尽管Clk和Cyc结合的基因数量相对较少，但这些靶基因可能对转录组产生超常的影响，因为其中许多编码转录因子、转录调节因子和RNA结合蛋白。与其他人一样，研究人员观察到核心分子时钟基因（如per和tim）的振幅在衰老过程中下降，这似乎是跨昼夜节律调节组织的衰老标志。研究人员提出，衰老光感受器中核心时钟表达振幅的下降部分源于转录激活动力学的受损，而H3K4甲基化的减少是原因之一。支持这一观点的是，在年轻果蝇中敲低H3K4甲基转移酶会类似衰老那样降低核心时钟基因的振幅，并且H3K4me2/3水平在老年光感受器中全基因组降低。研究人员推测，观察到的H3K4甲基转移酶敲低与衰老之间的重叠，可能是由于H3K4甲基化对于生产性转录延伸的重要性，而转录延伸反过来对节律性转录至关重要。
研究数据揭示，是H3K4甲基化的相对水平（而非其振荡模式）与转录峰值相对应。全基因组范围内存在Pol II占有率、染色质可及性和H3K4甲基化的动态模式，无论基因何时达到最大表达。一种可能性是，较高的H3K4me2/3水平增强了Pol II的释放速率并促进转录延伸，导致在ZT8至12之间出现表达峰值，而H3K4me2/3水平较低的基因则Pol II延伸减少，表达延迟。尽管研究表明H3K4甲基化是维持老年果蝇节律性转录的主要因素，但甲基转移酶的非组蛋白底物以及其他在老年果蝇中减少的组蛋白甲基标记也可能影响昼夜节律。
研究留下了一个悬而未决的问题：是什么导致了衰老视网膜中染色质的广泛变化，特别是组蛋白甲基化的减少？研究人员没有在甲基转移酶或去甲基化酶的转录或蛋白水平上观察到可以提供简单解释的变化，这表明可能有其他机制参与。一个可能的解释是，初级代谢存在年龄依赖性的变化，这产生了组蛋白修饰所需的许多底物和辅因子。尽管S-腺苷甲硫氨酸（SAM）丰度增加，但抑制性代谢物的同时积累和改变的代谢通量可能导致了观察到的年龄依赖性组蛋白甲基化减少。因此，作为衰老结果的代谢变化可能为解释为何昼夜节律在老年时期变得失调提供了一个解释。由于不同组织接收塑造表观基因组的独特代谢输入，衰老可能以不同的方式影响节律性基因表达，这取决于每个组织的表观基因组反应。
