引言
小细胞外囊泡（Small extracellular vesicles, sEVs）是一类由大多数真核细胞分泌的脂质纳米颗粒，直径约50-150纳米，因其携带来自母细胞的蛋白质、脂质和核酸等丰富货物，并在细胞间通讯中扮演关键角色，已成为下一代多功能纳米疗法的重要候选。其中，免疫细胞来源的sEVs，特别是M1极化巨噬细胞来源的sEVs（M1-sEVs），因其能耦合先天的免疫调节活性与治疗性负载的递送能力而备受关注。M1-sEVs保留了其母细胞的肿瘤抑制功能，包括重编程肿瘤微环境（Tumour microenvironment, TME）、激活免疫以及抑制癌症进展。然而，这些活性在肿瘤微环境中如何协调作用，以及它们是独立还是协同生效，仍不完全清楚。阐明这些机制对于充分利用其固有的生物活性，并结合其作为药物递送纳米载体的天然能力以优化治疗效果至关重要。
材料与方法
研究采用了RAW 264.7小鼠巨噬细胞系，通过脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激使其极化为M1型巨噬细胞。使用超滤方法从M0型巨噬细胞（未极化）、M1型巨噬细胞及3T3成纤维细胞中分离sEVs。通过透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）、纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle tracking analysis, NTA）和蛋白质印迹（Western blot）等技术对sEVs的形貌、粒径分布及标志物（CD9, CD63, CD81）进行了全面表征，并确认了免疫调节配体CD47的表达。通过基于质谱（Mass spectrometry, MS）的蛋白质组学分析sEVs的蛋白质组成。使用荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）和双光子共聚焦激光扫描显微镜（Two-photon conforal laser scanning microscopy, TP-CLSM）评估了sEVs在二维和三维肿瘤球体模型中的摄取和渗透情况。通过体内外荧光成像研究了sEVs的生物分布。采用实时荧光定量PCR（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析了sEVs中microRNA（miRNA）的表达。通过细胞活力（WST-8和Resazurin法）、划痕实验和克隆形成实验评估了M1-sEVs的抗增殖效果。利用手性石墨烯量子点（Chiral graphene quantum dots, GQDs）辅助策略将化疗药物阿霉素（Doxorubicin, Dox）高效加载到sEVs中。最后，在MCF-7乳腺癌细胞和荷瘤小鼠模型中评估了载药M1-sEVs的体外细胞毒性和体内抗肿瘤疗效。
结果
3.1 sEVs的分离与全面表征
研究成功从LPS刺激后的M1巨噬细胞中分离出sEVs（M1-sEVs）。TEM和NTA分析显示，M1-sEVs具有典型的球形纳米结构，平均直径约91.66 ± 19.16纳米（TEM）和134.4 ± 42.5纳米（NTA）。Western blot证实所有sEVs均表达标准标志物CD9、CD63和CD81，并且巨噬细胞来源的sEVs（M0-sEVs和M1-sEVs）显著表达免疫调节配体CD47，而3T3-sEVs则几乎不表达。CD47作为一种“别吃我”信号，有助于sEVs逃避免疫监视。体内外生物分布实验进一步证实，与3T3-sEVs相比，巨噬细胞来源的sEVs在肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统（Reticuloendothelial system, RES）器官中滞留较少，显示出更长的系统循环时间和更好的免疫逃逸特性。
3.2 蛋白质组学揭示M1-sEVs配体介导的肿瘤归巢特性
质谱蛋白质组学分析揭示了M1-sEVs表面表达多种与肿瘤靶向和微环境招募相关的蛋白质。这些蛋白质包括整合素β2（β2 Integrin）、半乳糖凝集素-3（Galectin-3, Gal-3）、血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR1）、CD44、神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1, NRP1）以及核仁素等。这些配体能够与肿瘤微环境中过度表达的细胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1）、细胞外基质成分（如透明质酸）以及生长因子（如VEGF）等相互作用，从而介导sEVs向肿瘤部位的特异性归巢。此外，M1-sEVs还表达了网格蛋白重链（Clathrin heavy chain, CHC）、网格蛋白轻链（Clathrin light chain, CLC）和含酪氨酸的蛋白质，这些成分可能通过促进网格蛋白介导的内吞作用来增强sEVs被肿瘤细胞的摄取。
3.3 M1-sEVs增强的细胞摄取与深部肿瘤球体渗透
功能实验验证了M1-sEVs优越的靶向和渗透能力。在EGFR高表达的MCF-7乳腺癌细胞中，FACS分析显示，与3T3-sEVs和M0-sEVs相比，M1-sEVs在37°C下表现出时间依赖性的最高摄取率，且该摄取在4°C时显著降低，表明是一个能量依赖性的主动过程。在三维MCF-7肿瘤球体模型中，TP-CLSM成像和定量空间分析进一步证实，M1-sEVs能够更深入、更有效地渗透到肿瘤球体内部。体内生物分布成像显示，静脉注射后，M1-sEVs在MCF-7荷瘤小鼠的肿瘤部位表现出最高且最持久的积累，显著优于3T3-sEVs和表面蛋白被酶解去除的“剃毛”sEVs（shaved-sEVs）。这些结果共同表明，M1-sEVs表面蛋白是其实现主动肿瘤靶向和深部渗透的关键。
3.4 M1-sEVs携带的肿瘤抑制性miRNAs及其抗乳腺癌效应
研究发现M1-sEVs富含多种来自母细胞的肿瘤抑制性microRNAs（miRNAs）。qRT-PCR分析显示，与3T3-sEVs和M0-sEVs相比，M1-sEVs中miR-150-5p、miR-150-3p、miR-181a-5p和miR-34a-5p/3p的表达量显著上调。这些miRNAs通过靶向不同的通路抑制肿瘤进展：miR-150通过抑制基质金属蛋白酶16（Matrix metalloproteinase 16, MMP16）来抑制肿瘤迁移和侵袭；miR-181a通过丝氨酸/苏氨酸激酶16（Serine/threonine kinase 16, STK16）通路影响细胞活力和凋亡；miR-34a则通过调节上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关的转录因子和p53来发挥肿瘤抑制作用。功能实验证实，M1-sEVs处理能显著抑制MCF-7细胞的增殖（WST-8和Resazurin实验）、迁移（划痕实验）和长期克隆形成能力（克隆形成实验）。通过抗miRNA抑制实验进行的基因挽救研究进一步证实，这些miRNAs是M1-sEVs发挥抗增殖作用的关键功能成分。
3.5 阿霉素负载的M1-sEVs的协同抗癌效应
研究利用手性石墨烯量子点辅助策略，成功将化疗药物阿霉素（Dox）高效加载到sEVs中，其中M1-sEVs的包封效率达到63.36 ± 2.65%。体外细胞毒性实验显示，Dox/M1-sEVs对MCF-7细胞的杀伤效果最强。在48小时处理后，Dox/M1-sEVs的半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration, IC50）降至0.46 µM，而游离Dox的IC50为1.45 µM，Dox/M0-sEVs和Dox/3T3-sEVs的IC50分别为1.35 µM和1.42 µM，表明M1-sEVs的固有抗癌活性与Dox递送产生了显著的协同效应。在MCF-7荷瘤小鼠的体内疗效评估中，Dox/M1-sEVs治疗组表现出最强的肿瘤生长抑制效果，肿瘤生长抑制率（Tumour growth inhibition, TGI）达到70.18 ± 11.37%，显著优于其他治疗组。组织学分析显示，Dox/M1-sEVs处理组的肿瘤组织出现最严重的核碎裂和组织结构破坏，表明协同治疗诱导了显著的肿瘤坏死，而对主要器官未见明显损伤，体现了良好的安全性。
讨论
本研究系统论证了M1-sEVs作为兼具固有抗癌活性和靶向药物递送能力的双重功能纳米治疗平台的巨大潜力。其优势主要体现在以下几个方面：首先，M1-sEVs继承了母细胞的膜蛋白（如CD47），能够有效逃避免疫清除，实现更长的体内循环时间。其次，其表面表达的一系列肿瘤归巢配体（如NRP1、核仁素、β2整合素等），使其能够主动靶向富含EGFR等受体的肿瘤细胞及肿瘤微环境成分，实现高效摄取和深部渗透。再者，M1-sEVs天然富集了多种具有协同作用的肿瘤抑制性miRNAs（如miR-150、miR-181a、miR-34a），为“一站式”基因治疗提供了内生性优势。最后，结合高效的手性GQDs载药技术，M1-sEVs成功负载化疗药物Dox，并在体内外实验中展现出远超单一疗法的协同抗癌效果。这种将内源性生物活性与外源性化疗药物递送相结合的策略，为开发下一代癌症组合疗法提供了创新且高效的平台。此外，M1-sEVs所展现的穿越血脑屏障并靶向脑部肿瘤的潜力，也为其在神经胶质瘤等难治性癌症中的应用开辟了前景。
结论
综上所述，本研究证明M1巨噬细胞源小细胞外囊泡（M1-sEVs）是一种高效的双重作用纳米治疗平台。它们不仅继承了母细胞的肿瘤抑制功能（包括免疫逃逸、肿瘤归巢和递送抗癌miRNAs），还能作为高效的纳米载体递送化疗药物。通过整合这两种机制，M1-sEVs在乳腺癌模型中实现了显著的协同治疗效果：体外将阿霉素的IC50降低了约3倍，体内实现了70.18%的肿瘤生长抑制。该工作为开发基于细胞外囊泡的、结合固有生物活性和药物递送能力的下一代癌症联合疗法奠定了坚实的基础。
