在我们的身体里，除了为人们所熟知的运输氧气的红色血液系统，还有一个同样至关重要的、负责回收组织液、运输免疫细胞的“清道夫”系统——淋巴系统。这个由淋巴管构成的网络一旦发育或功能异常，就会导致一系列疾病，例如先天性淋巴水肿、胸腔或腹腔乳糜液积聚等。尽管我们对淋巴管生成的调控有了一定了解，但其背后的精确分子机制，特别是在一些与特定基因突变相关的综合征（如RAS通路病）中为何会频繁出现淋巴管异常，仍有许多未解之谜。蓬发努南综合征（Noonan Syndrome with Loose Anagen Hair, NSLH）就是一种由SHOC2基因突变引起的RAS通路病，患者常伴有严重的淋巴功能障碍，但其致病机理尚不清楚。为此，研究人员在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》上发表了他们的研究成果，深入探究了信号支架蛋白Shoc2在淋巴管生成和稳态维持中的关键作用。
为了阐明Shoc2的功能，研究人员运用了多种关键技术。在体内模型中，他们利用携带Shoc2基因突变的斑马鱼品系，结合淋巴管特异性荧光报告基因（如Tg(mrc1a:eGFP)和Tg(kdrl:mCherry)），通过活体成像和形态学分析，直观地观察了淋巴管发育缺陷。他们还通过吗啉代反义寡核苷酸（Morpholino）敲低和内皮细胞特异性转基因回补实验，验证了Shoc2在淋巴管内皮细胞中的自主性功能。在体外实验中，研究人员使用人真皮淋巴内皮细胞（HDLEC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为模型。他们通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）稳定敲低Shoc2，并结合Shoc2或其突变体（S2G）的回补表达，系统研究了Shoc2缺失对细胞信号通路、基因表达和细胞表型的影响。关键的技术还包括RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）以探索全转录组变化，免疫印迹和免疫共沉淀分析信号通路蛋白的活性和相互作用，以及Seahorse代谢分析仪检测线粒体呼吸功能。
发育异常在Shoc2突变鱼中
研究人员使用了一个携带Shoc2基因c.1546 G>A突变的稳定斑马鱼品系（shoc2SA/SA ）。该突变导致mRNA中插入一个隐蔽外显子，产生提前终止密码子，造成Shoc2蛋白完全缺失。纯合突变体在发育第5天表现出广泛的水肿、鳔未充气和嗜睡，并开始死亡，无法存活超过11天。突变体还显示出颅面骨骼钙化减少、色素沉着异常等缺陷，表明Shoc2对斑马鱼胚胎发育至关重要。
Shoc2突变鱼中淋巴管发育缺陷
为了研究Shoc2在淋巴管发育中的作用，研究人员将shoc2SA/SA 突变体与淋巴管/血管双荧光报告斑马鱼杂交。在发育第5天，与野生型对照组相比，shoc2SA/SA 突变体的躯干淋巴管（包括胸导管TD、节间淋巴管ISLV和背纵淋巴管DLLV）和颅面淋巴管几乎完全缺失，而血管发育基本未受影响。这表明Shoc2的缺失特异性破坏了斑马鱼的淋巴管发育。
Shoc2突变鱼中淋巴祖细胞缺失
斑马鱼淋巴管发育始于后主静脉发出的次级出芽。活体成像显示，野生型胚胎能正常形成次级出芽并最终发育成旁索线（PL，即淋巴祖细胞结构），而shoc2SA/SA 突变体仅能产生少量、流产的次级出芽，完全无法形成PL，导致淋巴祖细胞近乎完全缺失。相反，从背主动脉发出的初级出芽（形成节间血管）在突变体中正常。这表明Shoc2的功能缺失特异性地损害了次级出芽形成和随后的淋巴管发育。
内皮细胞表达野生型Shoc2可拯救Shoc2突变体的淋巴管发育
为了验证Shoc2是否在淋巴管内皮细胞中自主发挥功能，研究人员在Shoc2敲低的斑马鱼胚胎中，通过镶嵌式转基因表达，在内皮细胞中特异性回补了野生型Shoc2。结果显示，Shoc2吗啉代敲低严重损害了PL的形成，而共注射表达野生型Shoc2（而非对照）的转基因可以部分拯救PL的形成。这证实了Shoc2在内皮细胞内自主地支持淋巴管发育。
Shoc2控制VEGF介导的ERK1/2信号幅度
鉴于在体研究Shoc2缺失导致淋巴管几乎完全缺失，难以深入研究淋巴内皮细胞（LEC）稳态，研究人员转向人真皮淋巴内皮细胞（HDLEC）模型。他们发现，Shoc2敲低显著降低了血管内皮生长因子（VEGF-C）刺激下的ERK1/2磷酸化，而回补Shoc2可以挽救这一缺陷，表明Shoc2调节HDLEC中VEGF介导的ERK1/2信号。有趣的是，Shoc2敲低的HDLEC培养6天后，表现出细胞形态变大、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加，以及TP53、p21Cip1 、p16INK4a 、IL-6等衰老标记物水平升高，呈现出明显的细胞衰老表型。而在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，Shoc2缺失的影响则小得多，提示Shoc2对LEC的增殖和生长有更严格的要求。
Shoc2缺失的HDLEC中的转录变化
为了揭示Shoc2缺失诱导衰老的机制，研究人员对对照、Shoc2敲低和Shoc2回补的HDLEC进行了RNA测序。基因集富集分析（GSEA）显示，Shoc2敲低的细胞中，“干扰素-α反应”和“干扰素-γ反应”基因集显著上调。qRT-PCR和免疫印迹证实，Shoc2敲低导致大量干扰素刺激基因（ISG）如ISG15、IRF7、MX1等表达上调，并且这种干扰素反应随时间推移而增强，可被Shoc2回补所逆转。在Shoc2敲低的斑马鱼幼体中，也观察到干扰素反应基因（如USP18, IRF7）的表达增加。这些结果表明，Shoc2的缺失在HDLEC中诱导了与先天免疫反应相关的转录变化。
Shoc2缺失在HDLEC中激活JAK1/STAT1细胞内信号通路
I型和II型干扰素主要通过Janus激酶（JAK）-信号转导与转录激活因子（STAT）通路启动ISG转录。研究人员发现，Shoc2敲低的HDLEC中JAK1（Y1034/1035）和STAT1（Y701）的磷酸化显著增加，并可被Shoc2回补逆转，证实了干扰素反应与JAK1/STAT1通路激活相关。使用MEK1/2抑制剂PD98059抑制ERK1/2通路，并不影响STAT1磷酸化或ISG表达，表明该干扰素反应独立于ERK1/2通路。相反，JAK1抑制剂ruxolitinib成功抑制了Shoc2敲低细胞中的干扰素反应和JAK1/STAT1通路激活。重要的是，在HDLEC中敲低Shoc2并表达Shoc2 S2G突变体，能引起与Shoc2敲低相似的干扰素/JAK1/STAT1反应，而在HUVEC和原代成纤维细胞中则没有。此外，用IFN-γ处理HDLEC6天可诱导细胞衰老。这些数据表明，Shoc2缺失或S2G突变体表达所引起的异常干扰素/JAK1/STAT1通路激活是HDLEC特有的。
Shoc2缺失的HDLEC中RIG-I样受体信号通路的激活
转录组分析显示，Shoc2敲低的HDLEC中，RIG-I样受体（RLR）信号通路基因显著富集。qRT-PCR证实，包括MDA5（IFIH1）、RIG-I（DDX58）在内的关键RLR通路组分表达上调。MDA5的激活需要其Ser88位点的去磷酸化。免疫沉淀实验显示，从Shoc2敲低或S2G表达的HDLEC中沉淀出的MDA5，其Ser88磷酸化水平显著降低，表明MDA5被激活。而在HUVEC中未观察到此现象。进一步敲低MDA5或其下游接头蛋白MAVS，可以消除Shoc2敲低HDLEC中的干扰素反应、JAK1/STAT1通路激活以及细胞衰老。这些结果证明，Shoc2敲低HDLEC中干扰素-JAK1/STAT1通路的激活依赖于MDA5-MAVS胞质模式识别反应。
Shoc2缺失的HDLEC的线粒体功能障碍
线粒体外膜蛋白MAVS影响线粒体稳态和动力学。研究发现，与对照相比，Shoc2敲低或表达S2G突变体的HDLEC中，线粒体分裂标记Drp1（Ser616）的磷酸化显著升高，其他线粒体融合蛋白（如OPA1）水平也发生改变。Seahorse代谢通量分析表明，Shoc2缺失显著降低了基础线粒体耗氧率（OCR）、线粒体ATP产量和质子漏，表明线粒体功能受损。衰老细胞的一个共同特征是线粒体双链RNA（mt-dsRNA）释放到细胞质中，这是衰老相关分泌表型（SASP）的关键驱动因素。免疫荧光分析和qRT-PCR显示，Shoc2敲低的HDLEC胞质中dsRNA和mt-dsRNA转录本水平显著升高。这些数据表明，mt-dsRNA在胞质中的积累很可能是Shoc2缺失HDLEC发生细胞衰老的诱因。
Shoc2对mTOR通路的调控
鉴于Shoc2敲低导致的干扰素反应独立于ERK1/2且伴有线粒体功能受损，研究人员探索了其他信号通路。先前研究表明，Shoc2可通过与mTORC1复合物的关键组分Raptor竞争结合mTOR，从而负调控mTORC1信号。本研究发现，在Shoc2敲低或S2G表达的HDLEC中，mTOR及其下游靶点4E-BP1和S6K1的磷酸化增加，表明mTORC1活性增强。免疫共沉淀证实，Shoc2敲低或S2G表达显著增加了Raptor与mTOR的结合，而mTOR与Rictor（mTORC2组分）的结合不受影响，且这一现象可被野生型Shoc2回补逆转。在HUVEC中则未观察到mTOR通路过度激活。为确认mTORC1激活与干扰素反应之间的机制联系，研究人员用mTOR抑制剂雷帕霉素处理细胞。雷帕霉素有效阻断了mTOR信号，抑制了Shoc2敲低和S2G表达HDLEC中的干扰素/JAK/STAT反应，使线粒体融合蛋白表达正常化，并阻止了细胞衰老的发生。此外，雷帕霉素处理部分恢复了Shoc2敲低斑马鱼幼体的淋巴管生成。
综上所述，本研究表明mTORC1（而非mTORC2）介导了Shoc2在HDLEC中的作用。Shoc2缺失或S2G突变破坏了Shoc2-Raptor-mTOR的平衡，增加了Raptor与mTOR的结合和mTORC1信号，进而影响线粒体功能，导致mt-dsRNA在胞质中积累，触发先天干扰素反应，最终引起细胞衰老。
在讨论部分，作者强调了本研究揭示了信号支架Shoc2在淋巴管调控中的关键新作用。Shoc2在淋巴管内皮细胞中具有特异性的功能：其缺失会激活mTOR和干扰素/JAK/STAT信号通路，破坏线粒体呼吸和功能，诱导细胞衰老，最终导致淋巴管生成缺陷。导致NSLH的Shoc2 S2G变异体在体外重现了这些功能障碍，为理解NSLH相关淋巴功能障碍的分子机制提供了相关证据。这些发现建立了Shoc2支架、线粒体功能、mTOR信号和LEC先天免疫反应之间的新机制联系，且这些效应具有细胞类型特异性。斑马鱼模型和内皮细胞特异性回补实验证实了Shoc2在淋巴管内皮细胞中的自主性和必要性。Shoc2通过平衡ERK1/2和mTORC1信号来维持LEC稳态。上调的mTORC1导致线粒体功能障碍，进而引起mt-dsRNA释放，激活核酸感知和促炎细胞因子产生，最终导致细胞衰老。值得注意的是，Shoc2在MDA5激活中的作用独立于其已知的Shoc2-PP1c-MRas全酶功能。已知干扰素γ对淋巴管有抑制作用，因此Shoc2缺失LEC中干扰素γ信号增加可能促进其衰老，并导致斑马鱼幼体淋巴管缺陷。这一发现也可能为NSLH患者自身免疫性疾病风险增加提供一种新机制。最后，作者指出，在Shoc2缺失和S2G变异细胞中观察到的进行性干扰素反应是mTOR依赖性的，并可被雷帕霉素逆转。这些发现强调了Shoc2作为平衡ERK1/2和mTOR信号分子看门人的关键作用，并突出了其细胞类型特异性功能，为了解ERK1/2和mTOR在发育性淋巴管生成中的作用提供了新视角。鉴于Shoc2、干扰素反应和mTORC1之间复杂的相互作用，靶向这些通路为治疗其他与淋巴功能障碍或异常免疫激活相关的RAS通路病提供了重要的治疗潜力。具体而言，JAK或mTOR抑制剂可能为Shoc2突变患者带来治疗益处，或许能减轻淋巴和免疫相关病理。
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