摘要：胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)是中枢神经系统(CNS)关键信号分子，通过嘌呤能受体(purinergic receptor)调控神经炎症反应。尽管炎症过程中星形胶质细胞和神经元在信号转导及代谢上发生显著改变，特定嘌呤能通路对炎症诱导神经退变的作用尚不清楚。研究人员发现，ADP/ATP激活的Gq偶联受体P2Y1在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，多发性硬化MS模型)中驱动星形胶质细胞介导的神经毒性。利用质膜靶向荧光素酶报告基因小鼠，研究人员证实急性EAE期胞外ATP水平升高，伴随星形胶质细胞P2ry1表达上调(该现象亦见于炎性MS病灶)。体内实验显示，药理学抑制或星形胶质细胞特异性敲除P2Y1可减轻疾病严重程度、星形胶质细胞增生及神经元丢失，而神经元特异性敲除仅产生微弱效应。机制上，星形胶质细胞P2Y1信号促进细胞因子诱导的ERK活化、炎性基因表达及代谢重编程。与P2Y1缺陷星形胶质细胞培养上清相比，P2Y1完整星形胶质细胞受刺激后上清降低神经元存活率，证实星形胶质细胞源性因子介导神经毒性；相反，神经元P2Y1信号主要参与氧化应激和线粒体功能障碍。上述结果表明，星形胶质细胞P2Y1是神经炎症损伤的关键调节因子及潜在治疗靶点。
论文解读——《Neuroglial P2Y1receptor signalling differentially contributes to inflammatory neurodegeneration》发表于《Journal of Neuroinflammation》
一、研究背景与立项依据
多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)是一种慢性自身免疫性中枢神经系统疾病，现有免疫调节疗法主要针对急性炎性活动，但对以渐进性神经功能缺失为特征的进展期MS疗效有限，炎症诱导的神经退变机制尚未完全阐明。星形胶质细胞(astrocyte)在神经炎症中可发生表型重塑，既能维持稳态也能转为神经毒性，但其具体调控通路不明。嘌呤能信号系统——尤其是代谢型P2Y受体在中枢神经系统驻留细胞中的作用——在MS背景下研究较少。P2Y1受体是ATP/ADP激活的Gq蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCR)，本研究旨在明确星形胶质细胞P2Y1信号在EAE/MS模型中驱动炎症性激素性神经退变的作用及细胞类型特异性差异。
二、主要关键技术方法
研究人员采用：(1) pmeLUC质膜靶向荧光素酶报告基因小鼠活体成像检测EAE急性期胞外ATP；(2) 星形胶质细胞条件性敲除(P2ry1flx/flx;GLAST-CreERT2，简称P2ry1-KOastro)及神经元条件性敲除(P2ry1flx/flx;SNAP25-Cre，简称P2ry1-KOneuro)小鼠构建EAE模型(MOG35–55诱导)，并行临床评分与组织学分析(NeuN、GFAP、Iba1、CD3染色)；(3) 公开单细胞RNA测序(snRNA-seq)数据集(GSE281176小鼠脊髓、GSE180759人死后白质)及空间转录组数据集(GSE279181 MS脑)再分析评估P2ry1表达分布；(4) RNAscope原位杂交检测P2ry1 mRNA；(5) 原代星形胶质细胞(PAC)与原代皮质神经元(PNC)体外培养、rAAV-CMV-Cre介导P2ry1敲除、细胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)刺激、条件培养基转移共培养、qPCR检测炎性基因(Il6、Nos1、Ccl2)、乳酸/谷氨酸分泌检测、CellROX活性氧(ROS)检测及TMRE线粒体膜电位检测；(6) P2Y1拮抗剂MRS 2179经鼻给药干预EAE小鼠及LC-MS检测脑内药物浓度。
三、研究结果
ATP release and astrocytic P2ry1 induction during CNS inflammation（CNS炎症期间ATP释放及星形胶质细胞P2ry1上调）
利用pmeLUC小鼠活体成像发现急性EAE期脑和脊髓胞外ATP显著升高。snRNA-seq再分析显示小鼠脊髓中P2ry1在星形胶质细胞中表达最高；RNAscope验证EAE急性期脊髓GFAP+星形胶质细胞中P2ry1 mRNA显著上调，人MS病灶周边P2RY1也富集于星形胶质细胞且空间转录组显示病变边缘P2ry1+位点增多。结论：急性神经炎症时胞外ATP升高，星形胶质细胞P2ry1选择性上调，在人和小鼠MS/EAE中均存在。
Astrocyte-specific deletion of P2Y1attenuates EAE severity（星形胶质细胞特异性敲除P2Y1减轻EAE严重程度）
体外原代星形胶质细胞中炎症细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β)上调P2ry1，P2Y1激动剂激活ERK1/2磷酸化，拮抗剂MRS 2179抑制细胞因子诱导的pERK。体内：经鼻给予MRS 2179呈减轻EAE趋势但因CNS渗透不足效果有限；星形胶质细胞特异性P2ry1敲除小鼠EAE慢性期临床评分显著降低、体重恢复更早，脊髓腹角NeuN+神经元丢失减少，GFAP+星形胶质细胞活化减弱，而CD3+T细胞浸润及Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞无显著差异。结论：星形胶质细胞P2Y1通过ERK信号促进EAE严重性，其缺失具神经保护作用且不依赖外周免疫细胞浸润改变。
P2Y1-dependent astrocytic activation induces a proinflammatory phenotype（P2Y1依赖性星形胶质细胞活化诱导促炎表型）
细胞因子刺激下P2Y1完整星形胶质细胞较P2Y1缺陷细胞显示更高GFAP强度与胞体/突起肥大，炎性基因Il6、Nos1、Ccl2表达上调更显著。P2Y1完整星形胶质细胞条件上清降低Neuro2a神经元存活率(LDH释放增加)，而P2Y1缺陷上清无此作用。P2Y1缺陷星形胶质细胞在炎症刺激后乳酸与谷氨酸分泌均低于对照组。结论：星形胶质细胞P2Y1信号促进反应性活化、促炎因子/趋化因子表达、代谢物(乳酸、谷氨酸)释放，并通过分泌因子介导神经元毒性。
Neuronal P2Y1signalling modulates excitotoxic and oxidative stress responses（神经元P2Y1信号调节兴奋毒性和氧化应激反应）
Transwell共培养中，谷氨酸诱导的神经元死亡在含P2Y1完整星形胶质细胞时加剧，P2Y1缺陷星形胶质细胞中共培养神经元死亡减少。原代神经元在谷氨酸或H2O2刺激后P2ry1表达上调；P2Y1拮抗剂降低ROS生成、激动剂增强之，P2ry1敲除神经元ROS较低且线粒体膜电位(TMRE)丢失减少。神经元特异性P2ry1敲除小鼠EAE评分轻度改善但无组织学神经保护证据。结论：神经元P2Y1参与氧化应激与线粒体功能障碍，加重神经元脆弱性，但在体主要神经退变由星形胶质细胞P2Y1驱动。
四、讨论与结论翻译
本研究表明星形胶质细胞P2Y1受体信号是EAE中神经炎症诱导神经退变的关键驱动因素。急性病期胞外ATP升高伴随星形胶质细胞P2ry1上调；遗传或药理学抑制星形胶质细胞P2Y1减轻疾病严重度、星形胶质细胞增生及神经元完整性保留，而神经元特异性敲除仅产生轻微临床获益。这确立星形胶质细胞P2Y1为炎症驱动神经元损伤的关键效应分子。在慢性自身免疫性神经炎症背景下，持续P2Y1激活促进有害的反应性星形胶质细胞表型——特征为细胞因子/趋化因子表达增加、代谢支持受损及神经毒性增强，可能经经典Gαq–PLCβ–Ca2+通路及NF-κB依赖转录程序实现，并破坏星形胶质细胞-神经元代谢偶联(乳酸减少)。该通路可与ATP释放形成正反馈环路放大神经炎症。神经元P2Y1增强ROS生成与线粒体去极化，但体内主要为星形胶质细胞介导毒性的继发效应。
结论(Conclusions)： 本研究确定星形胶质细胞P2Y1受体信号是神经炎症期间胶质-神经元通讯的重要介质，也是星形胶质细胞驱动的炎症及代谢功能失调的关键调节因子。这些发现将P2Y1定位为调控神经毒性胶质反应、限制MS等自身免疫病组织损伤的潜在治疗靶点。
