基质神经调节角膜的感觉功能，该功能可被手术、创伤或化学性损伤破坏。角膜施万细胞（corneal Schwann cells, cSCs）包绕轴突并提供营养支持，但其在轴突再生中的作用尚待阐明。研究人员利用蛋白脂质蛋白1-增强绿色荧光蛋白（proteolipid protein 1-enhanced green fluorescent protein, Plp1-eGFP）报告基因小鼠，在两种角膜神经损伤模型中研究cSCs：角膜微袋损伤（corneal micropocket injury, CMI）模型造成局灶性基质轴突切断，及氮芥（nitrogen mustard, NM）急性暴露模型造成全角膜及角膜缘钝性损伤。CMI后cSC网络于伤后7天（days post-injury, dpi）迅速下降，14 dpi恢复至未损伤对照组水平并伴有损伤区及旁侧区出芽；轴突数量显著低于cSCs，导致机械感觉功能受损。NM损伤导致cSCs和轴突持续缺失，机械感觉丧失持续至14 dpi。既往研究人员鉴定Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-related protein 1, DKK1）为cSCs中表达的新候选基因。本研究研制含小分子DKK1抑制剂的胶束制剂RM4404用于局部滴眼，并在两种损伤模型中检验其治疗潜力。在cSC再生期（7–14 dpi）应用RM4404可增强cSC修复，显著促进轴突再生并恢复两种损伤模型中的机械感觉功能。上述发现确定了一种有前景的DKK1靶向疗法，可促进cSC修复、增强角膜神经再生并恢复角膜感觉功能。
论文解读：《靶向角膜施万细胞中DKK1挽救角膜损伤后轴突再生与机械感觉功能》
本研究发表于《Journal of Neuroscience Research》。角膜是人体神经分布最丰富的组织，深层角膜基质切开类手术（如LASIK）或化学毒剂（如氮芥）暴露会造成基质神经轴突截断与退行性变，引起持续性角膜感觉减退（hypoesthesia）甚至神经营养性角膜病变（neurotrophic keratopathy），目前缺乏有效促神经再生的治疗手段。角膜施万细胞（corneal Schwann cells, cSCs）——一种包绕无髓鞘感觉轴突的非髓鞘化施万细胞（non-myelinating Schwann cells, nm-SCs）——被认为可提供神经营养支持，但cSCs在角膜神经损伤后是否具"修复型表型（repair SC phenotype）"及其对轴突再生的调控机制尚不明确。经典Wnt/β-catenin信号通路在周围神经系统（peripheral nervous system, PNS）再生中发挥重要作用，Dickkopf-1（Dickkopf-related protein 1, DKK1）是该通路的分泌型拮抗蛋白，可通过抑制LRP5/6阻断β-catenin信号；前期单细胞RNA测序发现兔中央角膜nm-cSCs特异性表达Dkk1转录本，但其对角膜神经再生的影响未见报道。为此，研究人员假设损伤后cSCs上调DKK1限制轴突再生，并通过药理学抑制DKK1可增强cSC介导的神经营养支持，从而促进角膜感觉神经修复。本研究利用Plp1-eGFP转基因小鼠分别建立机械性CMI与化学性NM损伤模型，动态表征cSC与轴突网络变化，开发含DKK1小分子抑制剂WAY-262611的Kolliphor HS-15胶束滴眼液RM4404进行局部干预，评估其对cSC存活、轴突再生及角膜机械敏感性（corneal mechanosensitivity）的影响，并检测Wnt通路激活标志物Axin2及DKK1蛋白定位变化以验证靶点作用。
主要技术方法：
研究人员采用Plp1-eGFP杂合转基因小鼠（B6;CBA-Tg(Plp1-eGFP)10Wmac/J）及野生型C57BL/6J小鼠建立两种损伤模型——角膜微袋损伤（corneal micropocket injury, CMI）模拟激光屈光手术局灶基质轴突离断，及0.2%氮芥（nitrogen mustard, NM）溶液局部暴露模拟化学性弥漫损伤。将DKK1抑制剂WAY-262611包载于Kolliphor HS-15制备胶束制剂RM4404行局部点眼。通过体内Micron III裂隙灯系统活体成像观察eGFP+cSCs；处死动物取角膜行全层铺片（whole-mount）免疫荧光染色标记cSCs（eGFP/PLP1/L1-CAM）与轴突（βIII-tubulin），利用FIJI软件Neuroanatomy插件量化荧光结构总长；Cochet-Bonnet触觉仪检测清醒小鼠角膜瞬目反射阈值评估机械感觉功能；角膜冰冻切片行H&E及Axin2、DKK1免疫组化；透射电镜表征胶束粒径。统计学采用Kruskal–Wallis检验或Mann–Whitney U检验。
研究结果：
3.1 Characterization of the Plp1-eGFP Transgenic Mice Line for Injury Studies
活体成像及全层铺片证实Plp1-eGFP小鼠角膜基质中eGFP均匀标记cSCs；CMI后5 dpi cSC网络减少、突起变细；1% NM致cSC近完全消失，0.2% NM致中央及周边cSC显著丢失但周边残存少量结构，故选0.2% NM用于后续药效实验。
3.2 Comparison of cSC and Axonal Networks in Mice Subjected to CMI
CMI后2 dpi cSC与轴突网络显著缩减，7 dpi cSC开始再生出芽（eGFP+sprouting structures增多），10–14 dpi cSC网络恢复接近未损伤水平；而轴突持续退化、14 dpi仍显著低于正常（p<0.05）。合并图像显示部分中周区轴突缺失但保留eGFP+cSCs。角膜机械敏感性自1 dpi起持续降低至14 dpi。结论：CMI模型中cSCs能固有再生但其旁分泌促轴突再生机制受损，导致轴突再生滞后于cSC网络恢复。
3.3 Comparison of cSC and Axonal Networks in Mice Subjected to 0.2% NM Chemical Injury
0.2% NM损伤后5 dpi eGFP+cSC与βIII-tubulin+轴突均显著丢失，14 dpi cSC几无恢复、轴突持续缺失，机械敏感性显著降低。结论：NM化学损伤广泛破坏cSCs与轴突，抑制cSC自身再生能力，造成持续性神经感觉缺陷。
3.4 DKK1 Is Highly Expressed in Mouse cSCs
免疫荧光共定位显示未损伤Plp1-eGFP小鼠角膜中DKK1与eGFP+cSCs重叠，亦与cSC标志物L1-CAM及PLP1共标，分布于角膜周边及中央区，包括周边有髓cSCs与中央无髓cSCs突起。结论：DKK1蛋白特异性表达于小鼠角膜cSCs各亚群。
3.5 Development of RM4404 for Topical Inhibition of DKK1
WAY-262611溶于Kolliphor HS-15形成均一胶束RM4404，透射电镜显示粒径约11.53±0.54 nm，4℃储存1月稳定，适于眼部局部给药；依据cSC修复出芽时相（7–14 dpi）设定延迟给药窗口。
3.6 Delayed RM4404 Treatment Promotes cSC and Axonal Regeneration and Improves Corneal Sensory Function in the CMI Model
CMI模型伤后7–14 dpi每日2次局部给予RM4404或Vehicle（胶束空白）。14 dpi RM4404组cSC网络与Vehicle/未治组无差异，但轴突总长较未治组显著增加（中位364.4 vs 187.9, p=0.0042），接近未损伤水平；停药随访至30 dpi，RM4404组轴突网络与未损伤无差异，Vehicle组仍低下；cSC网络RM4404组略高于Vehicle但仍低于正常。机械敏感性：7 dpi所有损伤眼均下降，14 dpi Vehicle组无改善，RM4404组恢复至接近正常；30 dpi Vehicle组仍低下，RM4404组维持正常感觉。结论：延迟DKK1抑制不改变cSC自身再生能力，但通过增强cSC源性神经营养/导向信号挽救轴突再生滞后并促进感觉功能持久恢复。
3.7 Delayed RM4404 Treatment Promotes cSC and Axonal Regeneration and Improves Corneal Sensory Function After NM Injury
0.2% NM损伤后7–14 dpi给RM4404，14 dpi cSC网络（中位136.1 vs 61.12, p=0.0012）与轴突总长（中位557.1 vs 425.8, p=0.0006）均显著高于Vehicle组，轴突长于cSC结构（p=0.0002）；机械敏感性恢复至未损伤水平。结论：DKK1抑制在化学损伤模型同样能促进残存cSC修复及轴突再生并恢复感觉功能。
3.8 Acute RM4404 Treatment Promotes Corneal SC and Axonal Regeneration and Improves Sensory Function After NM Chemical Injury
NM损伤当天起至7 dpi早期给药、停至14 dpi检测：RM4404组cSC（p=0.0317）与轴突（p=0.0159）网络均高于Vehicle，机械敏感性7 dpi即改善，14 dpi（停药7天）仍优于Vehicle。结论：早期DKK1抑制亦可部分挽救NM损伤后cSC丢失与轴突缺陷。
3.9 Delayed Treatment With RM4404 Is Superior to Early Treatment After NM Chemical Injury
比较同一NM模型中早期（0–7 dpi）与延迟（7–14 dpi）RM4404方案：延迟给药组cSC网络（p=0.0031）、轴突再生（p=0.0016）及14 dpi机械敏感性（p=0.0496）均显著优于早期给药组。结论：针对cSC修复/出芽期的延迟DKK1抑制比急性期给药疗效更优。
3.10 Delayed Treatment With RM4404 Antagonizes DKK1 In Vivo
CMI与NM模型Modified方案（5–10 dpi给药，14 dpi检测）免疫荧光显示：Vehicle组DKK1强共标于L1-CAM+cSCs；低剂量RM4404组DKK1呈点状沿cSC突起分布；高剂量组cSCs内DKK1进一步减少，部分DKK1出现于邻近基质细胞核。结论：RM4404呈剂量依赖性降低cSCs内DKK1蛋白水平，验证体内靶点结合/抑制。
3.11 Delayed Treatment With RM4404 Improves Corneal Tissue Architecture in NM Injury
H&E染色：CMI各组上皮/基质厚度无差异；0.2% NM Vehicle组上皮与基质明显变薄，RM4404低、高剂量组厚度均显著大于Vehicle（基质p=0.0038/0.0066，上皮p<0.0001）。结论：DKK1抑制除促神经再生外还可改善NM损伤后角膜组织萎缩。
3.12 Delayed Treatment With RM4404 Increases Axin2 Levels In Vivo
CMI与NM模型Modified方案Axin2免疫组化：Vehicle组上皮胞质基础染色；低剂量RM4404上皮胞质Axin2增强；高剂量组上皮出现核内Axin2且基质细胞胞质Axin2升高。结论：DKK1抑制解除Wnt/β-catenin拮抗，使下游靶基因Axin2上调，证实RM4404激活角膜内Wnt/β-catenin信号。
讨论与结论总结：
研究人员明确了角膜损伤后cSCs的时间依赖性再生动力学——CMI中cSCs于7 dpi起始出芽并重建网络但不完全支持轴突再生，NM损伤则广泛抑制cSC与轴突恢复。DKK1是cSCs特异表达的Wnt拮抗因子，损伤后持续高表达限制修复型cSCs的神经营养功能。局部应用DKK1小分子抑制剂RM4404胶束滴眼液在cSC修复期（7–14 dpi）可解除DKK1对Wnt/β-catenin的抑制（Axin2上调），增强cSC源性神经营养与导向信号，从而在不改变cSC自身网络重建的前提下显著促进轴突再生并恢复角膜机械感觉功能，效应在两种损伤模型均成立且在停药后持续；延迟给药优于早期给药，契合临床先控制炎症再促神经修复的需求。RM4404还能减轻NM损伤后角膜变薄，提示cSC-Wnt信号可能间接支持上皮稳态。综上，靶向cSCs中DKK1—Wnt/β-catenin轴是角膜感觉神经缺损的新型可药用靶点（novel druggable target），为术后或化学性角膜神经营养障碍提供了转化治疗策略。
研究局限包括依赖Cochet-Bonnet评估机械感觉、CMI操作技术要求高、性别差异未做大样本验证、RM4404对非cSC细胞Wnt激活的非自主效应需进一步解析。
