终末回肠活检的单细胞RNA测序鉴定克罗恩病发病机制特征

克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是一种慢性炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD），其临床表现和治疗反应存在显著异质性。为探索其分子基础，研究人员构建了IBDverse，这是一个大型终末回肠活检单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据集，对111例CD患者和232名健康对照的超过110万个细胞进行了分析。该资源整合了发现队列和重复验证队列，用于稳健识别与CD相关的细胞类型、基因和通路。研究揭示了以上皮改变为特征的病理图谱，其标志是由干扰素（interferon，IFN）驱动的主要组织相容性复合体I类分子（major histocompatibility complex class I，MHC-I）上调，并且这种改变在肉眼可见炎症消退后仍持续存在于祖细胞中。研究进一步鉴定出ITGA4⁺巨噬细胞是关键炎症驱动因素，这类细胞表现出JAK–STAT信号通路和细胞因子表达〔白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-12和IL-23〕富集。遗传力分析将炎症性单核细胞和巨噬细胞与CD易感性联系起来，提示驻留和募集而来的免疫细胞共同参与发病过程。这些发现为CD建立了系统性的细胞与分子层面框架，并为疾病机制阐释和治疗机会发掘提供了重要线索。

《Nature Genetics》发表的这项研究围绕克罗恩病（CD）的细胞与分子发病基础展开。CD是一种以慢性复发缓解性交替炎症为特征的炎症性肠病（IBD），最常累及终末回肠，但在病变部位、严重程度、病程行为以及治疗反应方面存在明显异质性。尽管抗肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、抗IL-12和抗IL-23等治疗已改善部分患者结局，原发无应答和继发失应答仍然常见，部分患者在确诊后数年内仍需接受手术。因此，厘清CD的细胞谱系异常、炎症通路和遗传易感性所对应的致病细胞，是扩展治疗靶点和提高精准干预能力的关键。既往胃肠道单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究虽已提示间质细胞重塑、T细胞异常及特定上皮细胞亚群参与IBD，但受限于样本量不足、疾病异质性高及技术噪声，其统计效能和可重复性有限。基于这一问题，研究人员构建了大规模终末回肠单细胞图谱IBDverse，以发现队列和重复验证队列并行设计，力图在稳健框架下识别CD相关细胞、基因和通路，并进一步结合遗传学证据评估其致病关联。

在方法学上，研究纳入英国剑桥Addenbrooke’s医院接受常规内镜检查者的终末回肠钳夹活检样本，包括111例CD患者和232名健康对照。研究人员对活检样本进行单细胞分离，并采用10x Genomics 3′平台实施scRNA-seq，构建总计超过110万个细胞的数据资源；从中以70份随机样本建立细胞图谱和分类器，再对全部343份样本自动注释。分析流程包括CellBender背景校正、Scrublet去除多重体、Leiden聚类、MAST差异表达分析、GSEA（gene set enrichment analysis，基因集富集分析）、CELLEX特异表达评分及CELLECT分层连锁不平衡评分回归遗传力富集分析。另以3名健康供体和4名CD个体来源的终末回肠类器官进行IFNγ刺激scRNA-seq验证上皮内在反应。

研究结果部分首先以“Atlassing terminal ileal biopsies identifies 57 cell clusters”为起点，建立了终末回肠单细胞表达图谱。研究人员对343名个体的活检进行分析，在代表性建图队列中鉴定出57个独特细胞簇，覆盖上皮、免疫和间充质区室。通过标志基因识别与人工注释，并训练细胞分类器推广至全部样本，研究显示该注释策略与外部公开回肠单细胞数据高度一致。发现队列与重复验证队列分别包含611,992个和573,869个通过质控的细胞。差异丰度分析显示，13种细胞类型在CD中显著富集，其中S100A8/9⁺单核细胞和CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞在健康髓系区室中几乎缺失，而在疾病状态下明显扩增；同时还发现CD特异性肠上皮细胞亚群，如GPX2⁺祖细胞和IFI27⁺绒毛细胞，呈现屏障应答和抗菌活性相关转录特征。

在“Dysregulated gene expression in CD”部分，研究人员系统评估了CD活动性炎症与健康对照之间的差异表达基因（DEGs）。在发现队列、重复验证队列和全队列中分别检出4,241个、4,166个和5,385个差异基因，且差异基因数量与测序细胞数正相关。然而，可重复性是该研究特别强调的问题：发现队列中仅44%的差异基因能够在重复验证队列中以同一细胞类型、相同方向再次显著出现。上皮细胞的差异表达可重复性最高，而浆细胞最低；不同免疫细胞亚群之间也存在明显差异。这一结果表明，单细胞差异表达研究在复杂患者队列中高度依赖样本规模、细胞注释质量与细胞丰度平衡，也解释了为何小样本研究往往难以稳定复现。

在“Pan-epithelial and cell-type-specific changes in active CD”部分，研究揭示了活动性CD中的广泛上皮应答。对可重复性较高的47类细胞进行GSEA后发现，12种上皮细胞类型沿隐窝—绒毛轴普遍上调I型干扰素（IFNα/β）信号，核心基因包括IFI27、HLA-A/B/C/E/F、IFITM3、PSMB8、STAT1和IRF1。同时，多条与MHC-I相关的通路显著富集，包括抗原加工与交叉呈递、MHC-I折叠装配与肽装载、内质网吞噬体通路及内体液泡通路。研究进一步显示，MHC-I通路上调与炎症严重程度相关，而且在非炎症CD活检相对健康对照的比较中，这种MHC-I抗原呈递增强仍然持续，尤其见于祖细胞和干细胞样群体，提示炎症消退后上皮系统仍保留“分子瘢痕”。类器官实验进一步支持这一结论：IFNγ刺激可在多数上皮细胞中诱导IFNγ信号及MHC-I抗原加工通路上调；未刺激类器官中也可见部分MHC-I通路轻度富集，与活检数据一致。相较之下，MHC-II相关基因上调仅局限于部分肠细胞和干细胞亚群，范围明显小于MHC-I，提示CD上皮异常以MHC-I主导的抗原处理程序更为突出。

在“ITGA4⁺ macrophages are enriched for JAK–STAT signaling”部分，研究将ITGA4⁺巨噬细胞界定为CD炎症中的关键髓系效应群体。ITGA4在ITGA4⁺巨噬细胞和CD163⁺⁺巨噬细胞中表达最高，其中ITGA4⁺巨噬细胞在活动性CD中显著扩增，且差异表达重复性最好。GSEA显示其细胞因子通路广泛富集，涉及多条白细胞介素信号，提示以IL-6和IFN超家族受体信号为主，并主要通过Janus激酶1（JAK1）、JAK2和酪氨酸激酶2（TYK2）介导。与此一致，JAK2和STAT1是其最显著上调基因，同时PTPN1/PTPN2等JAK–STAT负调控因子也上调。IL10、IL12和IL20表达水平还与炎症严重程度呈正相关。该群体同时上调蛋白酶体和免疫蛋白酶体相关基因，如PSMA4/5与PSMB8/9，提示其可能参与MHC-I介导的抗原呈递并与CD8⁺T细胞发生串扰。整体而言，ITGA4⁺巨噬细胞不仅是炎症扩增细胞群，而且是JAK–STAT与细胞因子网络的重要执行节点。

在“IBD genetics acts across gut cell populations”部分，研究将单细胞图谱与IBD遗传学风险相结合。研究人员考察了45个高可信度IBD候选效应基因在57种细胞类型中的特异表达，发现8大类细胞群均至少特异表达1个IBD效应基因，说明IBD遗传架构具有跨细胞谱系特征。例如，FUT2在多种肠细胞和干细胞群中高特异表达，且在祖细胞中最强，随着成熟而降低。NOD2这一西方回肠型CD最强遗传效应基因，则特异表达于S100A8/9⁺与SOD2⁺单核细胞及ITGA4⁺、CXCL9/10⁺等未成熟巨噬细胞，而非驻留巨噬细胞。研究还显示，OSM主要来源于这些NOD2⁺炎症性髓系细胞，而其受体OSMR则定位于成纤维细胞、内皮细胞和周细胞等间充质亚群。进一步的遗传力富集分析表明，只有免疫细胞显示出CD、溃疡性结肠炎和IBD的遗传力富集，尤其是S100A8/9⁺与SOD2⁺单核细胞、CXCL9/CXCL10⁺巨噬细胞、CD163⁺/CD163⁺⁺细胞和1型常规树突状细胞，以及若干T细胞亚群。这提示炎症反应细胞与免疫耐受细胞共同构成CD遗传易感性的细胞承载者。

讨论部分强调了三方面核心认识。其一，IBDverse作为大规模终末回肠scRNA-seq资源，通过发现—验证双队列设计，直接回应了单细胞组学可重复性质疑，并提示在异质性极高的疾病中，稀有细胞与注释不稳定细胞的差异表达极易失真，因此大样本与严格重复验证至关重要。其二，CD上皮存在由I型和II型IFN驱动的屏障应答，其中MHC-I相关程序沿隐窝—绒毛轴普遍增强，并在宏观炎症缓解后持续存在于祖细胞中，表明炎症可在上皮系统中留下长期分子印记。其三，ITGA4⁺巨噬细胞是活动性CD中细胞因子感知、JAK–STAT信号转导和免疫蛋白酶体相关抗原处理的重要枢纽，而遗传力富集进一步支持炎症性单核-巨噬细胞系统在CD发病中的因果相关性。

研究结论可概括为：研究人员构建了包含111例CD患者和232名健康对照、总计超过110万个细胞的终末回肠单细胞图谱IBDverse，并借助发现队列和重复验证队列鉴定和验证了与CD相关的基因、通路和细胞类型。研究发现，CD存在广泛的上皮改变，表现为IFN信号驱动及炎症后持续存在的MHC-I上调；同时，ITGA4⁺巨噬细胞是JAK–STAT信号和细胞因子产生的重要贡献者。遗传力分析进一步指出CXCL9/10⁺巨噬细胞和S100A8/9⁺单核细胞等免疫细胞群参与CD发病。这些结果为理解CD机制和识别潜在治疗靶点提供了重要资源与框架。