基于mRNA的流感疫苗可拓展人类B细胞应答广度

传统流感病毒疫苗诱导的抗体应答广度有限。基于mRNA的流感病毒疫苗是否能够在人类中诱导更优越的生发中心（GC）反应，仍不清楚。本研究在一项观察性队列研究中，评估了连续两个流感季接受已获许可的裂解病毒颗粒疫苗或研究性mRNA四价季节性流感病毒疫苗的健康青年成人的B细胞应答。基于mRNA的疫苗持续诱导更高的抗体滴度以及更高频率的记忆B细胞（MBC）。在引流淋巴结中，mRNA疫苗接种刺激了持续存在的GC反应，在两个流感季的受试者中，13人里有5人在接种后至少26周仍可检测到该反应。血清IgG抗体库的蛋白质组学分析显示，mRNA疫苗接种增加了疫苗诱导的血清IgG克隆型数量，并促进既有克隆型内部扩增（intraclonal expansion）。B细胞谱系分析进一步表明，这些扩增的血清克隆型可定位至与GC B细胞相关的亚分支，支持持续进行的GC驱动进化是克隆内扩增基础这一结论。上述抗体库重塑伴随着针对抗原性差异流感病毒的结合广度增加。这些发现揭示了持续性GC反应在拓宽疫苗诱导抗体库中的关键作用。

该研究发表于《Nature Immunology》，围绕基于mRNA的季节性流感疫苗是否能够在人类中诱导更持久、更具广度的B细胞免疫反应这一关键问题展开。流感病毒因持续发生抗原漂移，导致现有季节性疫苗需要频繁更新，而传统疫苗诱导的抗体常常主要集中于既往免疫记忆所偏向的有限表位，难以形成足够广谱且持久的保护。生发中心（GC，次级淋巴器官内B细胞发生克隆选择、体细胞高变异与亲和力成熟的微结构）是塑造高质量抗体反应和免疫记忆的核心环节，因此，阐明不同疫苗平台对GC反应、记忆B细胞（MBC）募集以及血清抗体库重塑的影响，对于开发更高效的流感疫苗具有重要意义。研究人员据此比较了研究性mRNA四价季节性流感疫苗mRNA-1010与已上市裂解病毒颗粒四价疫苗Fluarix在人类中的免疫学差异，重点考察了外周血、引流淋巴结和血清抗体库三个层面的B细胞应答特征。

在技术方法上，研究人员纳入2022–2024北半球两个流感季共75名20–50岁健康成人组成观察性队列，并在其中部分受试者中实施超声引导腋窝引流淋巴结细针穿刺（FNA）取样。研究综合采用酶联免疫斑点试验（ELISpot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、B细胞受体测序（BCR-seq）、血清IgG蛋白质组学测序（Ig-seq）、谱系树分析、多重荧光微球结合实验以及中和实验，对浆母细胞（PB）、GC B细胞、MBC及血清IgG克隆型进行纵向追踪分析。

结果部分首先在“mRNA-based seasonal influenza virus vaccination induces a robust humoral response”中显示，mRNA-1010可诱导更强的体液免疫反应。研究人员在两个连续流感季比较mRNA-1010与Fluarix后发现，接种后1周，两组均出现HA特异性PB应答峰值，但mRNA-1010组A/H1和A/H3特异性IgG⁺及IgA⁺ PB频率显著更高。相应地，在接种后4周以及末次随访时间点，mRNA-1010组针对A/H1和A/H3的血浆IgG结合滴度升幅更高，对流感B病毒HA也在4周时显示更高升幅。同时，mRNA-1010组循环HA特异性MBC扩增更明显。上述结果说明，相较裂解病毒颗粒疫苗，mRNA季节性流感疫苗能够诱导更强、更持久的峰值抗体反应和记忆B细胞应答。

在“Sustained GC response to mRNA vaccination”部分，研究证明mRNA-1010能诱导持续性GC反应。研究人员通过超声引导FNA重复采集同一引流腋窝淋巴结，利用流式细胞术直接分析GC区室。结果显示，在两个流感季中，仅mRNA-1010接种者于接种后26周仍可检测到HA特异性GC B细胞反应，13名受试者中有5名表现出持续GC，而Fluarix组未见此现象。进一步的scRNA-seq分析整合PB、MBC和FNA样本，基于转录组特征鉴定PB、GC B细胞、MBC等亚群，并结合配对重轻链BCR推断克隆关系。重组表达的单克隆抗体（mAb）验证了HA特异性克隆，从而使研究人员能够将HA特异性B细胞映射到不同转录组簇中。结果提示，mRNA疫苗不仅诱导持续GC，而且该GC与HA特异性反应密切相关。

在“GCs induced by mRNA-1010 recruit low-frequency MBCs and increase SHM”部分，研究显示mRNA-1010诱导的GC可募集低频MBC并增加体细胞高变异（SHM）。通过分析接种后1周PB与26周GC B细胞的克隆配对，研究人员发现mRNA-1010组克隆在GC中继续积累免疫球蛋白重链可变区基因（IGHV）与轻链可变区基因（IGLV）的核苷酸突变，表明这些既往抗原经验克隆在持续GC中发生进一步SHM。尽管未检测到结合亲和力显著提高，但GC中不仅存在IgG⁺ HA特异性B细胞，还可持续检测到IgA⁺ HA特异性GC B细胞，而Fluarix组相应细胞主要以IgG⁺为主。结合PB中IgA⁺细胞频率本就较低这一事实，结果支持mRNA-1010能够动员低频MBC进入GC反应，从而为抗体库多样化提供来源。

在“Higher number of vaccine-elicited clonotypes in serum following mRNA vaccination”部分，研究转向血清分泌型IgG抗体库层面，重点分析A/H3特异性应答。通过将液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）获得的血清IgG肽段与个体化BCR数据库匹配，研究人员界定了接种前已存在克隆型与接种后新近可检测的“疫苗诱导”克隆型。结果显示，mRNA-1010组在接种后4周及17/26周的A/H3特异性血清IgG克隆型总数更多，且4周时新近出现的疫苗诱导克隆型数显著增加。BASELINe分析进一步表明，这些新克隆型在互补决定区（CDR）中具有更强的抗原驱动正向选择信号，而框架区（FWR）未见相应增加。该结果说明，mRNA疫苗不仅增强了反应强度，也扩大了参与血清分泌抗体应答的克隆谱系范围。

在“Intraclonal expansion of pre-existing serum IgG clonotypes after mRNA vaccination”部分，研究揭示mRNA-1010还能促进既有血清IgG克隆型内部扩增。研究人员以每个既有克隆型内可检测到的独特CDRH3肽段数量衡量克隆内多样性。结果发现，mRNA-1010接种者大量高丰度既有克隆型在接种后出现显著CDRH3多样化，而Fluarix组多数既有克隆型在这一指标上变化有限。进一步统计显示，发生克隆内扩增的既有克隆型比例在mRNA-1010组约为Fluarix组的3倍，且这些扩增克隆型在接种后血清抗体库中的贡献更高，并持续至后续时间点。说明mRNA-1010不仅增加新克隆型的数量，也对既有免疫记忆相关克隆型进行“更新”，使其衍生出更广泛的变体集合。

在“GC-linked lineage structure underlies intraclonal expansion”部分，研究通过谱系树分析将血清克隆内扩增与GC演化直接联系起来。研究人员筛选出既在血清IgG中表现出CDRH3多样性扩增、又能在scRNA-seq中找到与GC B细胞相关序列的A/H3特异性克隆型。结果仅在mRNA-1010组识别出此类克隆型。谱系树显示，接种前已存在的分支与接种后新出现的扩增CDRH3变体分支彼此区分，而scRNA-seq鉴定的GC B细胞序列定位于这些接种后扩增变体对应的亚分支上。这一证据直接支持：持续GC反应驱动了血清中同源相关IgG变体的持续演化与输出。

在“Increased antibody binding and neutralization breadth as a result of mRNA vaccination”部分，研究人员进一步评估抗体谱系扩展是否转化为功能广度提升。结果显示，接种后新检测到的CDRH3肽段变体比例与A/H3血清滴度增幅呈正相关。多重荧光微球实验表明，mRNA-1010组在接种后4周对跨越50余年病毒演化的多种A/H1和A/H3 HA蛋白的血浆抗体结合增强更广，其中对A/H3的更高结合广度可持续至26周。单克隆抗体层面的分析提示，两组均存在一定交叉反应性，但具有更广组2型HA交叉结合能力的A/H3特异性抗体伴随更高SHM水平。中和方面，常规微量中和实验对A/H3N2未显示组间显著差异，但高通量测序中和实验显示，mRNA-1010组对13株中11株A/H1N1病毒的中和滴度升幅更高，对多数A/H3N2病毒也呈更高趋势，尽管后者未达统计学显著。总体而言，血清抗体库多样化与结合广度扩展相一致。

讨论部分强调，本研究表明mRNA-1010作为季节性流感疫苗平台，是裂解病毒颗粒疫苗的有效替代方案，其优势不仅体现在更高的峰值和末次时间点抗体滴度，更体现在持续GC、低频MBC募集、血清IgG克隆型增加以及既有克隆型内部扩增等一系列免疫学特征上。研究认为，持续GC活动使MBC得以再次进入GC并发生进一步SHM，从而拓宽抗体库，提升对抗原性变异流感病毒的结合广度。这种机制对于应对流感病毒抗原漂移具有重要意义，也为通用流感疫苗研发提供了支持。文中同时指出，尽管A/H3N2中和广度未显示显著统计学优势，但结合广度的提高仍可能增强调理作用、吞噬作用、补体活化和抗体依赖的细胞毒作用等保护功能。

研究结论可概括为：基于mRNA的季节性流感疫苗在人类中诱导更强的记忆B细胞召回反应和更持久的生发中心反应；这种持续GC活性促进血清IgG抗体库重塑，既增加疫苗诱导的新克隆型数量，也推动既有克隆型发生克隆内扩增与持续演化；最终，这种抗体库扩展转化为对抗原性差异流感病毒更广的抗体结合能力。上述发现揭示，持续性GC反应是拓宽疫苗诱导抗体谱系与免疫广度的关键生物学基础。