摘要：细胞衰老部分通过衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)促进炎性衰老(inflammaging)。R-loop是含DNA–RNA杂合链的三链核酸结构，在肿瘤先天免疫应答中发挥作用，但R-loop在细胞衰老及炎性衰老中的作用尚不清楚。本研究发现核来源的胞质R-loop促进SASP及炎性衰老。研究人员检测到衰老细胞胞质中核来源R-loop积聚，且富含α-卫星重复序列(α-satellite repeats)；这些胞质R-loop定位于胞质染色质片段(cytoplasmic chromatin fragments, CCFs)并激活cGAS–STING先天免疫通路从而驱动SASP。研究人员鉴定出Exportin-1(XPO1)–DEAD-Box Helicase 1(DDX1)复合物对R-loop核输出及其随后定位于CCFs至关重要。使用KPT-330抑制XPO1可阻断核R-loop导出及向CCFs的定位、减弱SASP、减轻年龄相关的炎症并延长健康寿命。研究结果表明核R-loop导出是抑制年龄相关炎症的潜在靶点。
本文发表于《Nature Aging》，研究围绕细胞衰老过程中核起源R-loop异常出核并激活cGAS–STING通路驱动SASP（衰老相关分泌表型）及炎性衰老的机制展开。现有研究表明细胞衰老伴随SASP促炎因子释放导致组织炎性衰老，胞质染色质片段（CCF）可激活cGAS–STING通路，但R-loop是否在衰老中介入该过程未知。本文通过多种细胞衰老模型、小鼠衰老及肿瘤模型，结合组学、生化及显微技术证明：一部分核内R-loop经XPO1–DDX1复合物主动转运至胞质，定位于CCF并被cGAS识别，激活STING通路诱导SASP；抑制XPO1可减少胞质R-loop、降低SASP及老年小鼠系统性炎症并延长寿命。
主要关键技术方法
采用致癌基因HRASG12V诱导人胚肺IMR90成纤维细胞早衰(oncogene-induced senescence, OIS)及顺铂诱导卵巢癌细胞治疗性衰老为体外模型；22月龄自然衰老C57BL/6J小鼠及NrasG12V经流体动力学尾静脉注射诱导肝细胞早衰小鼠为体内模型。关键技术包括：抗体非依赖的MapR全基因组R-loop测序、胞质DNA–RNA杂交免疫沉淀测序(cytoDRIP-seq)、R-loop结合蛋白质谱鉴定(LC–MS/MS)、电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、分馏纯化CCF、XPO1抑制剂KPT-330或shRNA敲低XPO1/DDX1/cGAS功能缺失实验、免疫荧光共定位及2′3′-cGAMP酶联免疫吸附测定。
研究结果
Cytoplasmic accumulation of nuclear-derived R-loops in senescent cells（衰老细胞中核来源R-loop在胞质积聚）
研究人员通过MapR全基因组R-loop测序及亚细胞分级slot-blot发现，早衰细胞总R-loop信号下降但胞质R-loop升高、核R-loop降低。cytoDRIP-seq显示胞质R-loop来源于核R-loop且显著富集于α-卫星重复序列；XPO1抑制剂KPT-330或XPO1敲低使胞质R-loop减少、核R-loop滞留，证实这些胞质R-loop源自核内并经XPO1依赖性主动导出。
Cytoplasmic R-loops localize to CCFs and promote the SASP（胞质R-loop定位于CCF并促进SASP）
免疫荧光显示胞质R-loop与CCF标记γH2AX共定位且可被RNase H消化。在衰老细胞中表达带核输出信号(nuclear export signal, NES)的胞质定位RNase H1(RH-NES)特异性降解胞质R-loop后，IRF3活化及SASP因子表达受抑，但SA-β-gal及p21不变；XPF/XPG敲低或KPT-330处理及XPO1敲低同样降低SASP。抑制CCF形成的TSA处理使R-loop无法定位至CCF且SASP不再被RH-NES进一步抑制，证明胞质R-loop需定位于CCF才能促SASP，且R-loop核输出与CCF形成是两个独立过程。
The XPO1–DDX1 complex mediates R-loop export and localization to CCFs（XPO1–DDX1复合物介导R-loop核输出及向CCF定位）
质谱筛选胞质R-loop结合蛋白发现DDX1显著富集并与R-loop直接结合(EMSA)，且与XPO1在衰老细胞中相互作用增强。DDX1含C端NES基序，NES突变体不能与XPO1互作且滞留核内。DDX1敲低使胞质R-loop减少、核内滞留，R-loop向CCF定位受阻但不影响CCF形成，SASP受抑；回补野生型或解旋酶失活K52A突变体DDX1可恢复，而NES突变体不能。cytoDRIP-seq及FISH证实DDX1敲低使胞质α-卫星重复来源R-loop丢失。表明DDX1作为XPO1适配蛋白介导R-loop核输出并协助其定位于CCF，且该过程不依赖DDX1解旋酶活性。
cGAS senses cytoplasmic R-loops and contributes to their recruitment to CCFs（cGAS感知胞质R-loop并参与其向CCF招募）
分别抑制RIG-I、MDA5、TLR3及cGAS后，仅cGAS特异性抑制剂G140取消DDX1敲低对SASP的额外抑制效果。Co-IP证实cGAS与胞质R-loop结合且依赖DDX1介导的R-loop输出。cGAS与R-loop及DDX1共定位于CCF但不直接与DDX1或XPO1互作。DDX1敲低使cGAS与R-loop共定位CCF减少，胞质2′3′-cGAMP生成及STING通路活化下降；回补野生型或K52A突变体DDX1可恢复cGAS向CCF定位，NES突变体不能。EMSA显示cGAS可直接结合R-loop结构并合成2′3′-cGAMP，DDX1不影响此催化活性。反之cGAS敲低不影响胞质R-loop总量及DDX1–R-loop互作，但削弱R-loop向CCF定位，表明cGAS与R-loop向CCF招募互为依赖。
DDX1-mediated R-loop export is required for SASP function in vivo（DDX1介导R-loop导出是体内SASP功能所需）
体内实验显示：衰老成纤维细胞条件培养基或共注射衰老成纤维细胞促卵巢癌细胞移植瘤生长，DDX1敲低削弱该旁分泌促瘤效应。NrasG12V联合shDdx1经流体动力学尾静脉注射诱导小鼠肝细胞早衰，Ddx1敲低使肝细胞CCF中R-loop及cGAS阳性率下降但不影响SA-β-gal阳性细胞数及CCF形成，免疫细胞簇招募减少，第14天衰老肝细胞清除率降低。证明DDX1介导R-loop出核对体内SASP驱动的免疫监视至关重要。
Targeting R-loop nuclear export suppresses inflammaging and extends lifespan（靶向R-loop核出口抑制炎性衰老并延长寿命）
22月龄小鼠灌胃XPO1抑制剂KPT-330不改变肝衰老细胞数及CCF形成，但减少胞质R-loop向CCF定位、降低肝SASP因子、CD3+/CD68+免疫细胞浸润、胶原沉积及血浆胆固醇与ALT，血浆TNF、IL-6及2′3′-cGAMP下降，逆转老龄相关内脏脂肪增加与肌肉减少。23月龄起始给药KPT-330显著延长小鼠寿命。表明抑制R-loop核出口可缓解炎性衰老并改善健康span。
讨论部分总结（研究结论翻译）
R-loop是基因组稳定性关键调控因子，其失调参与肿瘤与炎症。本研究发现衰老过程中一部分核R-loop经XPF/XPG从染色质切离后由XPO1/DDX1依赖方式主动输出至胞质，定位于CCF并被cGAS感知激活cGAS–STING通路，驱动SASP并促进炎性衰老。胞质R-loop向CCF定位需先后经DDX1介导核输出及cGAS结合共招募两个步骤。胞质R-loop富集α-卫星重复序列（中心粒卫星），可能与衰老中中心粒卫星去凝集及转录有关。抑制核R-loop出口足以减弱cGAS–STING活化及SASP，提示靶向R-loop核出口是缓解炎性衰老的潜在策略。
