AKAP1通过YTHDF2介导的G6PC mRNA衰变增强糖原蓄积与肝细胞癌发生

摘要：近年来，越来越多证据表明糖原（glycogen）代谢重编程是癌症的标志之一，在肿瘤发生发展中发挥重要作用，但其失调的分子机制仍很大程度上未知。本研究利用肝脏特异性AKAP1（A-kinase anchoring protein 1）缺失及过表达小鼠模型证明，AKAP1缺陷通过降低肝糖原含量显著抑制化学诱导（二乙基亚硝胺/四氯化碳，DEN/CCl4）及Akt/β-连环蛋白（β-catenin）癌基因驱动的自发肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC），反之AKAP1过表达促进糖原蓄积并加速自发肝癌发生。机制上，葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase, G6PC）的N6-甲基腺苷（m6A）依赖性mRNA衰变由YTHDF2（YTH domain-containing family protein 2）介导；研究人员发现YTHDF2是AKAP1在PKA依赖方式下直接磷酸化的底物（磷酸化位点为丝氨酸289和359），这对AKAP1引起的糖原蓄积及后续肝癌发生至关重要。此外，研究人员发现HCC细胞中AKAP1的表达受Myc相关锌指蛋白（Myc-associated zinc-finger protein, MAZ）转录上调。重要的是，使用竞争性肽类抑制剂AP-21破坏AKAP1的线粒体定位可显著降低糖原含量并抑制肝癌发生且无明显毒性，提示其作为HCC靶向治疗策略的转化潜力。综上，本研究揭示了AKAP1通过糖原代谢重编程驱动HCC的关键作用，确立AKAP1为该恶性肿瘤有前景的治疗靶点。

论文解读：AKAP1通过YTHDF2介导G6PC mRNA m⁶A衰变促进糖原蓄积与肝细胞癌发生

本文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

一、研究背景与目的

糖原是肝脏储存葡萄糖的重要聚合物，近年研究发现多种恶性肿瘤（尤其是肝细胞癌，hepatocellular carcinoma, HCC）存在糖原异常蓄积，且糖原不仅作为能量储备，还可通过相分离等方式驱动肿瘤起始，但调控糖原代谢重编程的分子机制尚不清楚。A-kinase锚定蛋白1（A-kinase anchoring protein 1, AKAP1）是位于线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）的支架蛋白，已知参与线粒体动力学及代谢性疾病，并在部分肿瘤中高表达，但其是否在HCC中介导线粒体信号与糖原代谢关联尚未阐明。本研究旨在明确AKAP1在HCC发生及糖原蓄积中的作用、上下游调控关系及分子机制，并评估靶向AKAP1的治疗潜力。

二、主要关键技术方法

研究人员采用肝脏特异性AKAP1敲除（AKAP1^LKO）及AAV8介导的肝细胞AKAP1过表达小鼠，建立DEN/CCl₄化学诱导及Akt/β-catenin睡美人转座子（hydrodynamic tail vein injection, HTVi）诱导的自发HCC模型，辅以慢病毒介导的G6PC敲低/过表达进行回补实验；收集272例人早期HCC组织标本进行免疫组化相关性及生存分析；通过免疫沉淀偶联液相色谱-串联质谱（co-IP-MS/MS）筛选AKAP1互作蛋白，体外激酶实验验证磷酸化位点（S289/S359），环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）追踪蛋白稳定性，RNA免疫沉淀（RIP）、甲基化RNA免疫沉淀（meRIP-qPCR）及mRNA衰变实验检测YTHDF2对G6PC mRNA m^{6A依赖性降解，染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）确认MAZ结合AKAP1启动子；使用AP-21（竞争性干扰AKAP1线粒体定位肽）进行体内外药效学及毒性评价。}

三、研究结果

AKAP1促进化学诱导及癌基因驱动的肝细胞癌发生

肝脏特异性AKAP1缺失显著减少DEN/CCl₄及Akt/β-catenin诱导小鼠肝肿瘤结节数、肝体比，延长生存期，降低Ki67增殖指数及血清ALT/AST；反之AAV8介导AKAP1肝过表达加速肿瘤形成、增大瘤体、缩短生存期。体外HCC细胞AKAP1敲低抑制增殖、迁移和侵袭，过表达促进之，表明AKAP1具促肝癌发生与进展功能。

AKAP1促进HCC细胞内外糖原蓄积

小鼠肝组织PAS染色及细胞PAS/2-NBDG荧光染色显示，AKAP1敲除降低肝及细胞内糖原含量，过表达升高之；人HCC组织中AKAP1蛋白水平与糖原阳性面积正相关，HCC细胞系中AKAP1 mRNA/蛋白与糖原含量正相关，且葡萄糖转运体（GLUT1/2/3/4）无显著变化，提示AKAP1内源性调控糖原合成/分解平衡而非葡萄糖摄取。

AKAP1通过下调G6PC表达促进糖原蓄积

qRT-PCR及Western blot筛查糖原合成分解关键酶，仅G6PC（葡萄糖-6-磷酸酶，糖原分解限速酶）在AKAP1过表达时mRNA及蛋白下调、敲除时上调；靶向代谢组学显示G-6-P（glucose-6-phosphate）及G-1-P（glucose-1-phosphate）在AKAP1过表达细胞中升高。G6PC共敲低可逆转AKAP1缺失导致的糖原减少，G6PC过表达可抵消AKAP1过表达引起的糖原增加。272例HCC组织显示AKAP1与G6PC蛋白负相关（r=-0.336, P<0.001），高AKAP1/低G6PC患者总生存期最短，AKAP1上调和G6PC下调均为HCC独立预后因素。

G6PC下调介导的糖原蓄积在AKAP1促肝癌发生中起关键作用

在AKAP1^LKO小鼠肝中慢病毒敲低G6PC可恢复被AKAP1缺失抑制的肿瘤发生（增加结节、肝体比、Ki67、PAS）；在AAV8-AKAP1小鼠肝中慢病毒过表达G6PC可拮抗AKAP1过表达驱动的成瘤，证实AKAP1主要通过G6PC↓→糖原↑→促HCC轴发挥作用。

AKAP1通过PKA依赖磷酸化YTHDF2 Ser²⁸⁹和Ser³⁵⁹稳定YTHDF2蛋白

co-IP-MS鉴定YTHDF2（m⁶A reader）为AKAP1互作蛋白，免疫荧光及FRET证实共定位。AKAP1敲低或PKA抑制剂H89加速YTHDF2蛋白降解，PKA激活剂FSK增强YTHDF2磷酸化；体外激酶实验证实AKAP1/PKA直接磷酸化YTHDF2野生型，S289A/S359A双突变完全取消磷酸化，且该双突变使YTHDF2胞内半衰期缩短、丧失促糖原蓄积能力。HCC组织中AKAP1与YTHDF2蛋白正相关（r=0.407, P<0.001）。

YTHDF2通过m⁶A依赖性mRNA衰变下调G6PC

YTHDF2敲低上调G6PC mRNA/蛋白，过表达下调之；meRIP-qPCR、RIP及CLIP证实YTHDF2直接结合G6PC mRNA的m⁶A修饰位点，放线菌素D追踪显示YTHDF2促进G6PC mRNA衰变，m⁶A位点突变或YTHDF2 YTH结构域点突变（W432A/W486A/W491A）丧失结合及促衰变能力。AKAP1敲低引起的G6PC上调可被YTHDF2过表达逆转，AKAP1过表达引起的G6PC下调可被YTHDF2敲低挽救，PKA活性调变与之一致，确认AKAP1→PKA→YTHDF2磷酸化→G6PC m⁶A-mRNA衰变→糖原蓄积通路。

AKAP1受MAZ转录上调

生物信息学预测及实验验证MAZ（Myc-associated zinc-finger protein）直接结合AKAP1启动子区（nt-404至-394），启动子截短及点突变消除MAZ转录激活；HCC中MAZ与AKAP1 mRNA及蛋白均正相关（r=0.365, P<0.001），MAZ敲低降AKAP1/YTHDF2、升G6PC并减糖原及恶性表型，过表达反之，且可被AKAP1干涉翻转，构成MAZ→AKAP1→YTHDF2→G6PC调控轴。

AP-21抑制肝细胞癌发生

AP-21肽（Ac-RRRRRRPLALPGMLALLGWWWFFSRKK-NH₂，阻断AKAP1线粒体定位）处理降低HLF细胞糖原、YTHDF2蛋白及G6PC mRNA衰变速率；在Akt/β-catenin诱导HCC小鼠中腹腔注射AP-21（2 mg/kg，每周两次×4周）减少肿瘤结节、肝体比，延长生存，降低Ki67及PAS染色，瘤组织YTHDF2↓/G6PC↑，主要脏器及血生化未见明显毒性，提示靶向AKAP1的可行性。

四、讨论与结论总结（翻译研究结论部分）

综上所述，本研究证明AKAP1通过YTHDF2介导的G6PC下调促进糖原蓄积进而驱动肝细胞癌发生，确立了AKAP1/YTHDF2/G6PC轴在糖原代谢重编程及HCC恶性进展中的作用，并表明通过AP-21肽靶向AKAP1可作为HCC潜在治疗策略。研究人员首次将AKAP1介导的线粒体信号与HCC中糖原代谢重编程直接关联，揭示YTHDF2受AKAP1/PKA磷酸化稳定的此前未被认识的翻译后调控机制，MAZ/AKAP1/YTHDF2/G6PC级联反应调控糖原蓄积与肝癌发生，AKAP1、YTHDF2及G6PC联合具有HCC预后预测价值。