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选自生物化学与生物物理学报 2000，32(2):95-99
bcl-2 基因的转录调控
季红斌 翟琦巍 刘新垣 郑仲承
（中国科学院上海生物化学研究所，上海200031）
摘要 许多不同的外界刺激，包括生长因子和细胞因子等都能诱导bcl-2基因的表达，而且很显然，这种受诱导表达的bcl-2对于细胞的存活是至关重要的。因此，为了对bcl-2的转录调控研究有初步的了解，将从转录水平和转录后水平两个层次上谈谈目前在该领域中的最新进展。
关键词 bcl-2；启动子；转录调控
细胞调亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一，根据美国ISI(Information Sciences Institute)对SCI对录及引用论文关键词检索发现，全球自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是细胞信号转导，细胞凋亡和基因组研究。近几年随着对细胞凋亡领域的深入研究，许多机制正在被逐步阐明，发现了许多重要的信号分子和信号事件，如Bcl-2家族、胱冬肽酶(caspase)家族、线粒体通透性的改变[1]、活性氧自由基ROS的水平、小G蛋白Ras、p53、细胞素c和凋亡蛋白前体Apaf-1的释放等。
在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起着至关重要的作用。它们具有较高的同源性，而且还有BH1、BH2、BH3、BH4等保守结构域[2]。Bcl-2家族可以分为两大类，一类是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等，另一类是促细胞死亡的，主要包括Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等[3]。Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等是细胞死亡的负调因子，在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上，与膜的结合对于其发挥功能是极其重要的。实验表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白抗凋亡能力减弱了许多[4]。有报道称在MDCK细胞中，特异性定位到线粒体膜上的Bcl-2突变体具有与野生型同样的功能，而定位到内质网上的Bcl-2突变体则失去了这种能力；但是，在成纤维细胞Rat-1/myc的研究结果却得到相反的结论，定们到内质网上的Bcl-2活性比定位到线粒体膜上的要高得多[5]。因此，不同亚细胞定位的Bcl-2突变体在不同细胞类型中可能参与不同的细胞凋亡信号途径。线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能来抑制凋亡：（1）Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位从而调控细胞凋亡。在细胞凋亡中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽（GSH）的外泄，降低胞内的氧化还原电位，来抑制细胞凋亡的；（2）Bcl-2能调节粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成份，它在较高pH的条件下能形成离子通道，而Bax则能在较为广泛的pH范围内形成孔道。Bax能允许一些离子和小分子如细胞色素c等穿过线粒体膜，进入细胞质，从而引起细胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封闭Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，从而保护细胞凋亡；（3）Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥凋亡作用。实验证明，尽管Bcl-2与胱冬肽酶之间无亲和力存在，但当二者在细胞中同时表达时却发现它们之间有相互作用。这种作用可能是间接的，是通过第三者CED-4来实现的。Bcl-2能与线虫中的CED-4结合并抑制其功能，而Apaf-1具有与胱冬肽酶结合的功能域，能参与细胞色素c依赖的胱冬肽酶激活。这表明Apaf-1就象线虫中CED-4一样，一方面能激活胱冬肽酶引起凋亡；另一方面又作为接头蛋白能把Bcl-2相关蛋白与胱冬肽酶聚集在一起，并使胱冬肽酶失活，从而保护细胞凋亡[5]。
Bcl-2家族中别的成员如Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等一方面可能通过与Bcl-2相关蛋白形成异源二聚体，使其失去抑制细胞凋亡的活性；另一方面可能也独立地参与细胞凋亡的调控。一个广为人们接受的假说认为Bax同源二聚体能促进细胞凋亡，而Bcl-2则通过与Bax竞争结合，形成异源二聚体来抑制细胞凋亡[6]。然而，在一此系统中，C对Bax的竞争结合并不能保护细胞凋亡，而在Bax缺少的情况下，Bcl-2过量表达也能阻止细胞凋亡。因此，Bax和Bcl-2之间尽管存在着竞争，它们可能独立地调控细胞凋亡。另外，目前发现别的蛋白如EGL-1和HrK也能与Bcl-2形成异源二聚体，从而导致细胞凋亡[7，8]。
对于Bcl-2的研究是细胞凋亡研究领域中最为热门的课题之一，除了对其功能的研究外，还包括对bcl-2基因的转录调控研究。许多生长因子和细胞轻子都能诱导bcl-2的表达，但很显然，不同细胞对于不同的刺激会产生不同的响应，对于bcl-2基因的表达调控方式也存在多样性和复杂性。下面我们将重点放在bcl-2基因的转录调控研究，谈谈目前在该领域中的最新进展。
1 bcl-2启动子的结构特性
人bcl-2基因有两个启动子，分别称为启动子1（promoter1,P1）和启动子2（promoter2,P2）[9]。在人体大多数细胞中，95%以上的bcl-2的转录是由P1启动，它位于翻译起始点上游约1.7kb处，没有典型的TATA盒，富含能被Sp-1结合的GC盒，P1驱动的转录主要从GC盒附近开始，这一点与别的持家基因的启动子十分相象。P1区的染色体结构分析表明它可能是组成型的启动子。P2位于P1区下游约1.3kb处（翻译起始点上游约80bp处），具有典型的CCAAT盒和TATA盒；与P1相比，P2主要是诱导型启动子，而且很少一部分bcl-2转录是由P2驱动[9]。
2 bcl-2基因表达的转录水平调控
2.1 不同转录因子对bcl-2的转录调控 （1）在bcl-2启动子区存在着一个受p53间接调控的位点。1993年，人们发现在人bcl-2的5`非翻译区有一个长度为1.3kb的负调区，这个负凋区位于bcl-2翻译起始点上游-85~ -279处，即位于P2区内。它的两个负调元件分别为：-279~ -195及-195~ -85。它的激活抑制了bcl-2的P1转录活性[10]。这个负调区在前B细胞株REH和成熟B细胞株DHL9中都是激活的，但其激活程度不同，这可能在B细胞的发育过程中起着相当重要的作用。
后来发现，在一些不表达p53基因的细胞，如小鼠骨髓瘤细胞M1和人肺癌细胞H358中，表达外源p53会导致bcl-2mRNA及其蛋白质水平的下降[11]。进一步分析表明，p53负调元件也位于bcl-2mRNA翻译起始点上游-85~ -279处。但很显然，在这区段中并没p53结合位点，p53对于bcl-2的这种转录调控就象它对mdr-1、c-fos、hsc-70等的调控一样都是间接的[12，13]，那么它是通过什么机制来诱导的呢？这个问题一直困惑着人们，直到后来发现转录因子Brn-3a能激活P2才恍然大悟[14]。在神经元细胞ND7中，bcl-2的转录主要是通过P2来介导的，Brn-3a能与P2中的DNA结合位点作用从而激活这种转录，而且Brn-3a对bcl-2转录激活能被p53特异性抑制，其机制在于p53能与Brn-3a的POU功能域结合[15]，因此p53可能通过干扰Brn-3a对bcl-2的转录激活而抑制bcl-2启动子活性。
（2）Myb家族成员对bcl-2的转录调控 在bcl-2转录调控中另外一个顺式作用元件就是Myb位点。在小鼠胸腺瘤细胞株EL-4中，能干扰c-Mby正常功能的突变体过量表达会导致细胞凋亡，究其原因是由于下调了Bcl-2的蛋白水平，外源bcl-2的导入能保护细胞免于凋亡[16]。另外，研究表明在骨髓瘤细胞中v-Myb直接参与bcl-2的转录调控，而这种作用需要完整的c-Myb位点的存在[17]。在IL-2依赖的小鼠T淋巴细胞CTLL-2中，c-Myb也能通过一种不依赖于其DNA结合位点的方式调控bcl-2的表达。有意思的是，最近一篇报道认为在CTLL-2细胞中过量表达B-Myb也能诱导bcl-2的表达从而抑制细胞凋亡[18]。但是，它们参与调控的位点也不同，c-Myb的调控位点位于bcl-2 P2中，而B-Myb参与结合位点则在P1下游约36~58处；而且与c-Myb不同，B-Myb对bcl-2的调控需要Myb位点的存 凇Ｕ馓崾玖嗽赾-Myb调控bcl-2基因表达的过程中，可能还存在着别的转录因子参与的协同作用。
（3）癌基因编码产物和病毒蛋白对bcl-2的转录调控 一些癌基因编码产物和病毒蛋白也能上调bcl-2的转录。BCR-ABL是9号染色体中蛋白激酶c-Abl基因转座到22号染色体Bcr基因中形成的融合蛋白，它主要通过激活Ras，使bcl-2组成性表达来实现其对细胞的转化作[19]。在U93细胞中，另外一个转座形成的融合蛋白AML1-ETO也能激活bcl-2基因的转录。奇怪的是，尽管AML1A和AML1B都能与bcl-2启动子区中的AML1位点结合，它们却不能激活bcl-2启动子的活性[20]，可能AML1对bcl-2的转录调控还需要别的转录因子的协同作用。此外，人免疫缺陷症I型病毒（HIV-）蛋白Tat在HeLa细胞和Jurkat细胞中也能增强bcl-2的表达[21]。因此，一些肿瘤细胞以及病毒感染细胞可能也通过bcl-2的过量表达从而实现不断的增殖分裂。
2.2 B淋巴细胞发育过程中bcl-2转录调控的多们性 在B淋巴细胞发育过程中，bcl-2的转录调控具有时相特异性。在前B细胞中，bcl-2的表达较低，因此会导致大量不成熟B细胞死亡；而在成熟B细胞中，bcl-2的表达量则较高[16]。与此相反，在瘤细胞株中，处于前期的B细胞表达高水平的bcl-2，而成熟的B细胞则表达低水平的bcl-2[22，23]。在前B细胞Nalm-6中发现，bcl-2的5`上游区有两个负调区段，包含了三个π1序列。进一步研究表明Ets家族转录因子参与π1位点的结合[24，25]。这两个负调区特异性地前B细胞中发挥作用，而在成熟的B细胞中则没有活性，因此，这提示bcl-2的转录调控与B淋巴细胞的发育相关。
在成熟B细胞BAL-17中的研究表明，用IgM的抗体处理会增强bcl-2的表达。在不成熟的B细胞株Ramos中的实验得到同样的结论。这些不同刺激都导致cAMP响应元件结合蛋白（CREB）的133位Ser磷酸化而激活，从而与bcl-2启动子区的cAMP响应元件（CRE）位点结合并激活其转录[26]。
2.3 细胞因子和生长因子对bcl-2的转录调控 关于细胞因子参与的bcl-2转录调控研究报道较少。目前发现，在PC12细胞中，神经营养因子（NGF）能诱导bcl-2转录增强，从而使细胞免于凋亡。这种bcl-2的转录调控需要Raf-1、MEK-1、p42/p44MAPK的依次激活，而与NGF激活的别的途径如PKA或PKC等无关[27]。在bcl-2启动子中，受p42/p44MAPK诱导调控的区段主要位于编码区上游1414~1472。
IL-2对于bcl-2的转录调控也有少数的几篇报道。1997年人们发现在小鼠T细胞TS1αβ细胞中，IL-2可以通过激活RhoA来诱导bcl-2转录[28]；另一则报道来自转录因子Aiolos的研究[29]。IL-2培养下，TS1αβ细胞中的Aiolos主要位于细胞核内，不与Ras结合；而在去除IL-2的情况下，Aiolos会慢慢地从细胞核内转移到细胞质中，并与Ras结合；IL-2重新刺激会导致Aiolos被磷酸化，并在与Ras解离后入核。在bcl-2的启动子区有三个Aiolos结合位点，细胞核内的Aiolos能与它们结合并参与bcl-2的转录调控，因此这提示IL-2通过使Aiolos进入细胞核来诱导bcl-2的转录，从而抑制细胞凋亡。
此外，IL-2还可能通过激活Akt(又称PKB)而诱导bcl-2和c-myc转录并发挥其生物学功能[30]。BA/F3细胞是一个IL-3依赖的原B淋巴细胞，在转染IL-2Rβ后，它就变成IL-2依赖。但是，转染IL-2Rβ.△S(即S区缺失体，去掉aa 267~ 322)的BA/F3细胞在48~72h就会发生细胞凋亡，即使加入IL-2也不能抑制定种凋亡。当再转入一个组成性激活的Akt突变体时，这种转染了IL-2Rβ.△S的BA/F3细胞会诱导bcl-2和c-myc的表达，从而使细胞能依赖于IL-2存活。在这一细胞体系中，主要运用了Akt过量表达的技术，因此使结果显得并不可靠，而且Akt的作用更大程度上可能只是互补了IL-2Rβ的S区的功能。这是目前为止关于Akt能诱导bcl-2转录的唯一的一篇报道。事实上，有报道称Akt可以磷酸化Bcl-2家族成员Bad，使其失去诱导细胞凋亡的能力从而抑制细胞死亡[31]。另外，在成纤维细胞中的研究表明，Akt不能诱导bcl-2和c-myc的转录表达，但可以通过抑制CED3/ICE类蛋白酶的活性来使细胞免于凋亡的发生。我们在BA/F3β细胞中的研究结果也表明，组成性激活的Akt能部分抑制IL-2撤离所引起的细胞凋亡，但Northern结果证明Akt的激活对于bcl-2的mRNA水平并没有多大的影响，因此，Akt可能不是直接诱导bcl-2的转录，而是通过与一些凋亡相关的信号分子相互作用来介导其抗凋亡作用的。另外，我们在BA/F3β细胞中的研究结果还表明，过量表达Jak-Stat通路抑制剂Jab不但能抑制tnf-β的诱导表达[32]，而且能抑制bcl-2的转录；由于bcl-2启动子并不象tnf-β启动子那样具有Stat5的调控位点，而且在共转染Stat5的情况下，tnf-β的启动子受调控，而bcl-2启动子并不受影响。这说明Jab不是通过Jak-Stat来介导bcl-2的转录调控的。目前，bcl-2启动子中受Jab调控的具体区段的研究还在进行中。
3 bcl-2基因表达的转录后调控
在正常淋巴系统中，在一级淋巴滤泡的小淋巴细胞中Bcl-2的蛋白含量很高，而在生发中心几乎检测不到Bcl-2蛋白的表达；奇怪的是，在生发中心bcl-2的mRNA水平很高。这暗示了正常淋巴系统中，存在着一种特异的bcl-2转录后调控方式。研究发现，在bcl-2翻译起始点上游-84~ -119处，有一个翻译抑制元件，它的存在不会影响bcl-2的转录水平，但能专一性下调其蛋白翻译水平[33]。这说明在不同组织，不同细胞中，可能存在着bcl-2不同的调控方式，这对正常的淋巴细胞的发育和成熟是非常重要的。
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